УДК 363.7-092.9:616.72-007.17-008.8:612.398.12:612.015.31
Спиркина Е.С., Матвеева Е.Л., Гасанова А.Г., Степанов М.А. ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова" Минздрава России, г. Курган
Введение. Дегенеративные заболевания суставов приобретают всё большую медицинскую и социальную значимость, так как демографическая ситуация развитых стран характеризуется постарением населения, а образ жизни цивилизованного человека приводит к деградации суставного хряща даже в сравнительно молодом возрасте. Биохимический мониторинг внутренней среды организма и ранняя диагностика патологического процесса в суставах становятся все более актуальными.
В литературе известны способы моделирования остеоартроза в эксперименте путем воздействия на сустав химических, физических. механических и травматических факторов, но существует необходимость усовершенствования и разработки новейших методик моделирования дегенеративно-дистрофических изменений в суставах в эксперименте, для возможности исключения неблагоприятных факторов, вызывающих это заболевание [1, 3, 4, 9, 10].
Известно, что процессы пероксидации связаны с одним из главных факторов в патогенезе остеоартроза - нарушением трофики суставного хряща [6]. Нарушение микроциркуляции в суставных концах и функций сустава связывают с застойными явлениями и последующими развитиями дегенеративно-дистрофических процессов [1].
Целью данного исследования послужило изучение изменений в системе перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ) у экспериментальных животных на ранних и поздних стадиях развития дегенеративно-дистрофических изменений в суставах (ДДИС).
Материалы и методы исследования. Экспериментальное моделирование остеоартроза проводили на взрослых беспородных собаках путем иммобилизации обоих коленных суставов с пересечением бедренной артерии по разработанному одним из авторов способу [8]. Основным материалом исследования являлась сыворотка крови 30 беспородных собак: интактных (n=10), с моделью ДДИС (n=20) на ранних стадиях (28 суток n = 14) и с моделью дегенеративных изменений в суставах на поздних стадиях заболевания (56 суток n=6). Критерием сроков эксперимента служила клинико-рентгенологическая характеристика состояния суставов.
Общее количество белка определяли биуретовым методом (наборы фирмы "Vital Diagnostic", г. Санкт-Петербург), электрофоретическое разделение белковых фракций проводили с использованием прибора для электрофореза Helena ("BioSciens Europe", Англия) производя расчет альбумин-глобулинового коэффициента, доли а-, р- и у-глобулинов. Продукты ОМБ в сыворотке крови определяли в белковом осадке по реакции 2,4-динитрофенилгидразином. Альдегиды ОМБ регистрировали при длинах волн 270 нм, 363 нм и 370 нм - (ОМБ270), - кетоны ОМБ (ОМБ363+370). Концентрацию продуктов ОМБ рассчитывали в единицах оптической плотности на мг белка [2].
В качестве количественных маркеров глубины и степени патологического процесса использовали такие промежуточные вещества ПОЛ, как диеновые конъюгаты (ДК) и малоновый диальдегид (МДА). Спектрофотометрически определяли по разности оптической плотности между опытной и контрольной пробами при длине волны 232 нм содержание ДК [7]. По реакции с тиобарбитуровой кислотой проводили определение МДА. Замер светопоглощения проводили при длине волны 532 нм, в кювете с длиной оптического пути 1 см [7]. Концентрации данных продуктов ПОЛ рассчитаны на мг общих липидов, которые определены наборами фирмы "Lachema". Концентрации холестерина (ХЛ) и триглицеридов (ТГ) определяли колориметрическим методом, основанным на определении концентрации вещества по интенсивности окраски раствором "наборы фирмы Vital-Diagnostic" (г. Санкт-Петербург). Активность фермента каталазы, определяли спектрофотометрически при длине волны 410 нм, выявляя способность образовывать стойкий окрашенный комплекс перекиси водорода с солями молибдена [5]. Маркером патологического процесса при развитии ДДИС в сыворотке крови являются уроновые кислоты (УК) [11].
Измеряли спектрофометрически при длине волны 540 нм против контроля (контроль и стандарт использован без гидролиза). Результаты определения ПОЛ и ОМБ были представлены в виде расчетного коэффициента суммы [ДК+МДА], [Альдегиды+Кетоны] и отношений [ДК/МДА], [Альдегиды/Кетоны].
Результаты исследования и обсуждение. Результаты, полученные при исследовании белкового и липидного спектра, а также показатели пероксидации в сыворотке крови животных в контрольной группе и при создании модели ДДИС представлены в таблице 1.
Таблица 1. Биохимические показатели уроновых кислот, липидного спектра и системы ПОЛ-АОС в сыворотке крови собак в норме и при моделировании остеоартроза на ранних стадиях развития ДДИС (медианы значений и интерквартильные размахи)
| Показатель, ед.изм. | Контрольная группа (n = 10) | Опытная группа (n=14) |
|---|---|---|
| Уроновые кислоты, ммоль/л | 4,40 (4,17;5,21) | 6,20005 (5,00;6,39) |
| Общие липиды, г/л | 3,36 (3,17;4,92) | 4,79 (4,28;5,50) |
| Холестерин, ммоль/л | 6,08 (4,05;6,23) | 4,85 (3,76;6,41) |
| Триглицериды, ммоль/л | 0,38 (0,36;0,43) | 0,48 (0,43;0,54) |
| Диеновые конъюгаты, нмоль/г Ол | 12,67 (6,75;20,46) | 18,97°'05 (13,75;24,47) |
| Малоновый диальдегид, нмоль/г Ол | 1,23 (1,12;2,54) | 3,80005 (2,62;4,32) |
| Каталаза, мкатал/ г ОБ | 1,41 (0,86;2,10) | 1,29 (1,10;1,41) |
| ДК+МДА | 15,58 (7,56;51,96) | 74,95°'05(37,05;112,40) |
| ДК/МДА | 10,30 (6,02;11,05) | 5,98 (4,44;6,09) |
Примечание: верхний индекс - уровень значимости (р) по сравнению с контрольной группой.
Показатель УК в сыворотке крови возрастал относительно тяжести дегенеративного процесса в суставе. Исследования показали, что при развитии ДДИС показатели ОЛ оставались на уровне значений контрольной группы. Также можно отметить, что все показатели липидов находились в пределах нормальных значений. Концентрации продуктов ПОЛ - имели статистически значимую тенденцию к повышению. Одним из неблагоприятных последствий ПОЛ считают образование МДА вследствие разрыва полиненасыщенных жирных кислот, обусловленного образованием свободных радикалов. Активность антиоксидантного фермента - каталазы не имела различий от контрольной группы. Расчетный коэффициент суммы продуктов ПОЛ [ДК+МДА], соответственно, был выше нормальных значений ввиду того, что происходило увеличение первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Соотношение продуктов пероксидации липидов [ДК/МДА] не показало различий, то есть наблюдалось пропорциональное распределение продуктов ПОЛ.
Результаты сравнительной оценки показателей ОМБ в сыворотке крови экспериментальных животных приводим в таблице 2.
Таблица 2. Биохимические показатели ОМБ и состав белковых фракций в сыворотке крови собак в норме и при моделировании остеоартроза на ранних стадиях развития ДДИС (медианы значений и интерквартильные размахи)
| Показатель, ед.изм. | Контрольная группа (n=10) | Опытная группа (n=14) |
|---|---|---|
| Общий белок, г/л | 73,05 (71,22;75,92) | 76,45 (75,15;79,85) |
| Альдегиды ОМБ, ед.опт. пл./ г ОБ | 0,08 (0,06;0,09) | 0,05005 (0,04;0,05) |
| Кетоны ОМБ, ед.опт. пл./ г ОБ | 0,01 (0,01;0,01) | 0,01 (0,01;0,01) |
| Альдегиды+Кетоны (10-3) | 0,8 (0,6;1,10) | 0,3005 (0,2;0,3) |
| Альдегиды/Кетоны | 8,22 (6,34;9,01) | 7,02 (6,19;8,69) |
| Белковые фракции: Альбумины, % | 62,77 (59,75;63,68) | 36,80005 (35,47;40,07) |
| агглобулины | 5,06 (4,13;5,57) | 3,00 (2,57;7,02) |
| а9-глобулины | 9,10 (8,61;10,62) | 14,95005(14,22;15,30) |
| р-глобулины | 16,11 (12,60;17,54) | 26,100001(23,92;28,87) |
| Y-глобулины | 9,00 (8,06;9,09) | 15,00005 (14,92;17,62) |
Примечание: верхний индекс - уровень значимости (р) по сравнению с контрольной группой.
Отмечено, что у собак на ранних стадиях внутрисуставной патологии изучаемые показатели в сыворотке крови отличались от контрольной группы и имели свои особенности. Альдегиды ОМБ, в свою очередь, статистически значимо снижались с уровнем значимости р<0,05. Данный продукт образует с аминогруппами белка шиффовы основания, выступая при этом "сшивающим" агентом. В результате "сшивки" образуются нерастворимые "комплексы-пигменты" изнашивания или конечные продукты окисления внутри клеточных белков. Кетоны белков находились на дооперационном уровне. Рассмотрев расчетный коэффициент [Альдегиды+Кетоны], следует отметить его снижение, а соотношение [Альдегиды/Кетоны] не имело отличий от нормы. Состав белковых фракций сыворотки крови у экспериментальных животных с моделью ДДИС мы приводим также в таблице 2. Согласно полученным результатам анализа сыворотки крови на белковые фракции можно отметить, что мы наблюдали такой тип нарушения, как диспротеинемия. Снижение альбумина может быть связано с повышенной потерей белка. Это может быть обусловлено острым воспалением, а именно об этом говорит повышение концентрации фракции а2-глобулины. Повышение содержания фракции Y-глобулины непосредственно указывает на развитие дегенеративно-дистрофических изменений в суставах, особенно с экссудативным характером.
Таким образом, в сыворотке кроки экспериментальных животных с ранними стадиями ДДИС обнаружено статистически значимое повышение продуктов ПОЛ и превышение в 2 раза суммарной концентрации продуктов ПОЛ, но снижение в 1,5 раза продуктов ОМБ, что свидетельствует о дисбалансе продуктов пероксидации липидов и белков, накоплении свободно радикальных соединений липидной природы, которое приводит и способствует развитию патологических процессов в суставной полости.
Биохимические исследования сыворотки крови собак при моделировании остеоартроза на поздних стадиях показали значительные изменения в продуктах перокисдации липидов и липидного спектра,
что отражено в данных таблицы 3.
Таблица 3. Биохимические показатели уроновых кислот, липидного спектра и системы ПОЛ-АОС в сыворотке крови собак в норме и при моделировании остеоартроза на поздних стадиях ДДИС (медианы значений и интерквартильные размахи)
| Показатель, ед.изм. | Контрольная группа (n = 10) | Опытная группа (n=6) |
|---|---|---|
| Уроновые кислоты, ммоль/л | 4,40 (4,17;5,21) | 6,48°'05 (5,33;6,61) |
| Общие липиды, г/л | 3,36 (3,17;4,92) | 14,48005(14,38±14,57) |
| Холестерин, ммоль/л | 6,08 (4,05;6,23) | 3,63005 (3,57;3,69) |
| Триглицериды, ммоль/л | 0,38 (0,36;0,43) | 0,710'05 (0,65;0,75) |
| Диеновые конъюгаты, нмоль/г Ол | 12,67 (6,75;20,46) | 1,58005 (1,51;1,63) |
| Малоновый диальдегид, нмоль/г Ол | 1,23 (1,12;2,54) | 0,95 (0,69;1,19) |
| Каталаза, мкатал/ г ОБ | 1,41 (0,86;2,10) | 1,10 (1,05;1,15) |
| ДК+МДА | 15,58 (7,56;51,96) | 1,50005 (1,04;1,93) |
| ДК/МДА | 10,30 (6,02;11,05) | 2,43001 (1,71;3,14) |
Примечание: верхний индекс - уровень значимости (р) по сравнению с контрольной группой.
Приведенные данные по концентрации УК позволяют говорить о разрушении органического матрикса суставных поверхностях при поздних, далеко зашедших стадиях остеоартроза, независимо от его генеза. Мы не отметили возрастания концентрации ОЛ на ранних стадиях, а на поздних стадиях концентрация ОЛ статистически значимо превышает нормальные значения в 4 раза. Изменение липидного спектра отражено в снижении концентрации ХЛ и повышении концентрации ТГ
На ранних стадиях концентрация первичных продуктов ПОЛ- ДК-имела тенденцию к повышению, также как и концентрация вторичных
продуктов ПОЛ- МДА- была статистически значимо выше нормы. На поздних стадиях развития заболевания продукты ПОЛ как первичные, так и вторичные были ниже нормы. Активность каталазы определялась без статистически значимых изменений.
Биохимические показатели ОМБ и состав белковых фракций в сыворотке крови собак на поздних стадиях развития заболевания представлены в таблице 4.
Таблица 4. Биохимические показатели ОМБ и состав белковых фракций в сыворотке крови собак в норме и при моделировании остеоартроза на поздних стадиях ДДИС (медианы значений и интерквартильные размахи)
| Показатель, ед.изм. | Контрольная группа (n=10) | Опытная группа (n=6) |
|---|---|---|
| Общий белок, г/л | 73,05 (71,22;75,92) | 80,55 (79,85;81,27) |
| Альдегиды ОМБ, ед.опт. пл./ г ОБ | 0,08 (0,06;0,09) | 0,05005 (0,04;0,06) |
| Кетоны ОМБ, ед.опт.пл./ г ОБ | 0,01 (0,01;0,01) | 0,01 (0,01;0,01) |
| Альдегиды+Кетоны (10-3) | 0,8 (0,6;1,10) | 0,5005 (0,4;0,6) |
| Альдегиды/Кетоны | 8,22 (6,34;9,01) | 4,50005 (4,25;4,75) |
| Белковые фракции: Альбумины % | 62,77 (59,75;63,68) | 30,23005(27,99;32,33) |
| а^глобулины | 5,06 (4,13;5,57) | 2,64001 (2,35;3,00) |
| а2-глобулины | 9,10 (8,61;10,62) | 15,59005(14,02;17,31) |
| р-глобулины | 16,11 (12,60;17,54) | 29,32005(28,47;29,82) |
| у-глобулины | 9,00 (8,06±9,09) | 15,22001(15,10;15,34) |
Примечание: верхний индекс - уровень значимости (р) по сравнению с контрольной группой.
Результаты исследований, проведенных нами в сыворотке крови собак, показали, что концентрация ОБ оставалась на уровне контрольных значений. Концентрация продуктов ОМБ статистически значимо понижалась только в альдегидах, концентрация кетонов оставалась без изменений. Соответственно, в виду снижения концентрации альдегидов ОМБ были снижены и расчетный коэффициент [Альдегиды+Кетоны], и соотношение [Альдегиды/Кетоны]. Снижалось процентное содержание фракции а1-глобулинов. Существенные изменения наблюдались в содержании а2-глобулиновой, р-глобулино-вой и Y-глобулиновой фракций, которые были статистически значимо выше нормальных значений. На ранних стадиях мы наблюдали только повышение содержания фракции Y-глобулинов.
Полученные нами результаты показывают статистически значимые изменения в составе сыворотки крови собак на поздних стадиях развития патологического процесса, а именно: увеличение в 4 раза концентрации ОЛ, изменение липидного спектра с двукратным повышением значений ТГ и снижением концентрации ХЛ в 2 раза. Кроме того, отмечено значительное (в 8 раз) понижение концентрации ДК, и некоторое (на 23%) - МДА, чего мы не наблюдали при развитии остеоартроза на ранних стадиях. В ОМБ были снижены только концентрации альдегидов ОМБ, что было отмечено и на ранних стадиях ОА. Статистически значимое возрастание концентраций а2-глобулиновой, р-глобулиновой и Y-глобулиновой фракций указывает на наличие воспалительного процесса и хронической формы заболевания.
Список литературы:
Резюме. На взрослых беспородных собаках проводили экспериментальное моделирование остеоартроза путем иммобилизации обоих коленных суставов аппаратом Илизарова с пересечением бедренной артерии. Основным материалом исследования являлась сыворотка крови 30-ти беспородных собак: интактных (n=10), с моделью ДДИС (n=20) на ранних стадиях (28 суток n=14) и с моделью дегенеративных изменений в суставах на поздних стадиях заболевания (56 суток n=6). Сроки эксперимента определяли по клинико-рентгенологической характеристике состояния суставов. Изучали биохимические показатели сыворотки крови на разных стадиях патологического процесса. Цель исследования - изучение изменений перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ) у экспериментальных животных на разных стадиях развития дегенеративно-дистрофических изменений в суставах (ДДИС). Результаты данного исследования показывают статистически значимые изменения в составе сыворотки крови собак на разных стадиях развития патологического процесса. Отмечено, что на поздних стадиях развития заболевания происходит понижение концентраций первичных и вторичных продуктов липопероксидации, чего не наблюдали при развитии остеоартроза на ранних стадиях. В продуктах окислительной модификации белков были снижены концентрации альдегидов белков, как на ранних, так и на поздних стадиях патологического процесса. Статистически значимое возрастание концентраций а2-глобулиновой, р-глобулиновой и у-глобулиновой фракций указывает на наличие воспалительного процесса и хронической формы заболевания. Полученные результаты исследования могут быть использованы для ранней диагностики патологического процесса в крупных суставах, и служить дополнительной информацией при постановке диагноза.
Ключевые слова: собаки, остеоартроз, перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков, дегенеративно-дистрофические изменения в суставах, сыворотка крови, диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, общий белок, общие липиды, альдегиды, кетоны.
Сведения об авторах:
Спиркина Елена Сергеевна, лаборант-исследователь лаборатории биохимии ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. ГА. Илизарова" Минздравсоцразвития России; 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6; тел.: 8 (3522) 45-05-38; е-mail: spirkina.82@mail.ru.
Матвеева Елена Леонидовна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. ГА. Илизарова" Минз-дравсоцразвития России; 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6; тел.: 8 (3522) 45-05-38; e-mail: matveevan@mail.ru.
Гасанова Анна Георгиевна, младший научный сотрудник лаборатории биохимии ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова" Минздравсоцразвития России; 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6; тел.: 8 (3522) 45-05-38; е-mail: gasanova08@mail.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Степанов Михаил Александрович, ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук, ветеринарный врач лаборатории гнойной остеологии и замещения дефектов конечностей ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова" Минздравсоцразвития России; 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6; тел.: 8 (3522) 45-46-36; е-mail: m-stepanov@mail.ru.
http://vetkuban.com/num5_201608.html