Карташов СИ., Ермаков А.М., Ключников А.Г., Миронова ПЛ.,
Миронова А.А., Ярошенко Н.В., Бойко В.П. Северо-Кавказский з
ональный научно-исследовательский ветеринарный институт,
г. Новочеркасск
Бабезиоз собак является широко распространенным во всем мире, клинически существенным, трансмисивным гемопротозойным заболеванием. Только в Ростовской области зараженность собак бабезиозом в период с марта по июнь достигает 35% [1].
На сегодняшний день в отечественной ветеринарной литературе сложилось несколько устойчивых стереотипов относительно бабе-зиоза собак, вот некоторые из них: бабезиоз легко диагностируется в острую стадию заболевания: на собаках паразитирует только один вид пироплазм, который не поражает другие виды животных, а пироплазмы других видов животных не поражают собак: пироплазмоз передается только через укусы клещей или при переливании крови: на ранних стадиях заболевания пироплазмоз легко лечится, а не леченые собаки, как правило, погибают: для пироплазмоза нехарактерно носительство.
Разные виды бабезий часто называют пироплазмами, что является собирательным термином для рода бабезий и тейлерий. Эти два рода за последние 10 лет подверглись скрупулезному генетическому исследованию, что привело к изменению в классификации таксономии этих паразитов. По международной классификации роды Babesia spp. входят в семейство Babesiidae. надсемейство Piroplasmida в пределах типа Apicomplexa. кроме того, в надсемейство Piroplasmida входит также и род Theileriidae.
В англоязычной литературе по величине бабезий при световой микроскопии выделяют "большой" бабезиоз (при обнаружении в мазках крови методом световой микроскопии бабезий размерами более 3-5 urn). На сегодняшний день мы знаем, что это такие бабезий. как В. canis и В. vogeli. О "малом" бабезиозе говорят при обнаружении в мазках крови бабезий менее 3 urn. это В. gibsoni (табл 1). Несмотря на кропотливое наблюдение за паразитами в мазках крови, в течение почти ста лет. классификация бабезий не шла дальше, чем классификация их по морфологическим особенностям и размерам. Впервые предложил классифицировать возбудителей бабезиоза собак по клиническим признакам заболевания немецкий протозоолог Эдвард Рейчнов, который выявил серьезные различия в тяжести клинического течения и патогенности возбудителей, вызывающих бабезиоз во Франции и на Севере Африки. Наиболее вероятно, что сейчас эти паразиты известны как В. cams и В. rosi соответственно. До 1980-года никаких новых изменений в номенклатуру возбудителей бабезиозов внесено не было, и только с появлением молекулярных методов диагностики и молекулярного генотипирования возбудители бабезиоза собак были переклассифицированы. Последние исследования бабезиоза собак сосредоточены на определении таксономического статуса известных и недавно обнаруженных возбудителей бабезиоза. улучшении диагностических методов, раскрытия аспектов патофизиологии этого заболевания и поиск новых химиотерапевтических и им-муннопрофилактических протоколов.
Такой возбудитель бабезиоза собак как В. canis в 2000 году был повторно классифицирован в три подвида В. canis canis. В. canis rossi и В. canis vogeli [2. 3]. В 2005 году, на основании перекрестных иммунных реакций, серологического тестирования, векторной специфики и генетического родства, эти паразиты признаны независимыми видами В. canis. В. rossi и В. vogeli. Все три паразита названы большими (крупными бабезиями. по ранее предложенной морфологической классификации) (табл. 1) [2. 3].
Таблица 1. Виды пироплазм, паразитирующие на собаках
| Вид | Синоним | Вектор передачи | Географ. распростран. | |
|---|---|---|---|---|
| Большой бабезиоз | Babesia vogeli | Babesia canis vogeli | Rhipicephalus sanguineus | Широкое распространение |
| Babesia canis | Babesia canis canis | Dermacentor spp. | Европа | |
| Babesia rossi | Babesia canis rossi | Haemaphysalis elliptica | Районы Сахары, Африка | |
| Babesia sp. | Неклассиф Babesia sp | Неизвестен | Северная Каролина, США | |
| Малый бабезиоз | Babesia gibsoni | Babesia gibsoni Азиатск. штамм | Haemaphysalis longicornis. собачьи бои | Азия, включая Японию |
| B. conrаdae | В. conradae | Ixodes hexagonus | Запад США | |
| Theileria annae | Babesia microtilike | Ixodes hexagonus | Испания, Португалия, Spanish isolate | |
| Theileria sp | Неклассифиц. Theileria sp | Неизвестен | Южная Африка | |
| Theileria annulata | - | Неизвестен | Африка. Европа, Азия | |
| Theileria equi | Babesia equi | Неизвестен | Африка, Европа, Азия | |
Четвертая крупная группа бабезий. паразитирующих на собаках, выделена в Северной Каролине (США) от собак с клиническими и гематологическими признаками бабезиоза. На сегодняшний день она еще не классифицирована, и определена как неклассифицированная крупная Babesia sp.. изолят из Северной Каролины (табл. 1) [2].
Большинство специалистов признают, по крайней мере, три возбудителя "малого" пироплазмоза у собак они отличаются по клиническим и генетическим характеристикам это Babesia gibsoni. Babesia conradae. В другом исследовании бабезий были выделены от больных собак на западе США и описаны в оригинальном исследовании как gibsoni [3. 4]. и Babesia microti-like. последняя позже идентифициро вана как Theileria annae [5. 6] (табл. 1).
Кроме того, имеются сообщения о выделе нии из крови собак, больных бабезиозом трех раз новидностей Theileria. У небольшого числа собак в Европе были выделены Theileria (Babesia) equi и Theileria annulate. У 82 собак в Южной Африке была выделена неклассифицированная Theileria sp - Южно-Африканская Theileria sp. [5. 6].
При световой микроскопии - интроэритроцитарные стадии Babesia spp. неразличимый от Theileria spp. Известно, что на кошках паразитирует Babesia felis и тейлерия Cytauxzoon felis. которые, при световой микроспории имеют такие же характеристики, как и бабезий собак. Однако, данных о том. что эти возбудители могут поражать собак, нет.
Как и при решении многих других вопросов касающихся таксономии, не обошлось без разногласий при классификации пироплазм собак, особенно это касается, так называемых, малых пироплазм. Исторически роды Babesia и Theileria. были разделены на основании стадий жизненного цикла и трансовариальной передачи в клещах. [2]. Противоречие заключается в том. должны ли Babesia spp. и Theileria spp. классифицироваться на основании их естественного цикла в организме собаках и клещей, или могут использоваться генетические данные молекулярного анализа. С 2000 года при классификации пироплазм предпочтение отдают генетическим аспектам возбудителей. При молекулярных исследованиях, в основном, используютлокус субъединицы рибосомального гена 18S РНК для родовых отличий пироплазм, поскольку эта часть гена достаточно устойчива к мутациям. Но другие рРНК гены, например цитохрома Ь. и гены, кодирующие белки теплового шока, также использовались для родовой идентификации [5. 8].
На сегодняшний день установлены зоны распространения бабезиоза собак, они перечислены в таблице 1: имеется всесторонняя и современная карта распространения клещевых инфекций собак Европы. Восточной и Юго-Восточная Азии [2]. Как и ожидалось, географическое распространение клещевых инфекций полностью связано с географическим распространением клещей - переносчиков этих заболеваний. Интересно отметить, что распространение Babesia gibsoni не связано с распространением каких-либо клещей, и быстрое глобальное распространение этого патогена, связано с его уникальной возможностью прямой передачи от больной собаки кздоровым через укусы, минуя какие-либо клещевые векторы [9. 10].
Все данные по распространению различных видов бабезий получены из зарубежной литературы и касаются распространения бабезиоза за пределами Российской Федерации. Данные по распространению различных видов бабезий в России в доступной отечественной литературе мы не нашли, что и определило цель нашего исследования.
Цель исследования: установить наличие носительства бабезиоза у собак на территории Ростовской области, выяснить векторы передачи бабезиоза и виды бабезий, паразитирующих на собаках в данном регионе.
Материал и методы исследования. Исследования были проведены на 100 собаках, поступивших в клиники Ростовской области в период с начала октября по конец ноября. Все собаки были клинически здоровы, и у них не ставился диагноз бабезиоз за весь предшествующий весенне-летний период. У животных отбиралась и стабилизировалась EDTA кровь. Исследования на бабезиоз проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.
Анализ нуклеотидных полноразмерных геномов и участков различных генов бабезий. взятых из базы данных GenBank (NCBI) последовательностей, проводили с применением пакета прикладных программ "BioEdit 6.0". Исходя из нуклеотидного состава геномов бабезий разных видов нами были выбраны участки 18S рРНК-гена. наиболее консервативные среди известных изолятов. На консервативные участки были рассчитаны родоспецифические праймеры BabspF (5' -GTTG CTTCTTAG AG GG ACTTTGG -3') и BabspR (5-GCTCTAAGCCCTGAGG AAG11 lAAG-3 ). фланкирующие участок в 282 пары нуклеотидов (п.н.).
Для идентификации вида бабезий исследовалась кровь от собак на присутствие видоспецифичных участков гена 18S рРНК. Исходя из диагностической ценности эксперимента для обнаружения кДНК конкретных видов бабезий. был выбран "стандартный" вариант ПЦР. С этой целью были сконструированы праймеры BrosF (5-CTCACCAGGTCCAGACAAACG-3) и BrosR (5-GTAGGATTGACAGATTGATAGCTC-3) к В. rossi. BcanF (5' -G ATTCTTTG GGTG GTG GTGCATG-3") и BcanR (5-CGTTCTTAGTTGGTGGAGTGAT-3) к В. cams и BvogF (5-TGTCTGGTTAATTCCGTTAAC-3 ) и BvogR (5-GAACGAGACCTTAACCTGCTAACT-3) к В. vogeli. Рассчитанные видоспе-цифичные праймеры для выявления кДНК имели высокую температуру отжига 62-64"С. это позволило объединить два этапа реакции (отжиг и элонгацию), в один. В результате удалось значительно снизить время постановки реакции, что не повлияло на ее специфичность и чувствительность. Постановку ПЦР проводили в реакционной смеси стандартного состава с использованием 10 пкМ каждого праймера. 5 мкл раствора кДНК с добавлением 3 мМ MgCI (рис. 1,2).
Рис. 1. Исследование методом ПЦР в реальном времени на родовые гены бабезий. Из 100 исследованных проб 12 оказались положительными.
Рис. 2. Исследование в ПЦР (с детекцией в электрофорезе) на видоспецифич-ные участки гена 185 рРНК бабезий.
Результаты исследования.
Нами были собраны клещи с территории Ростовской области с идентификацией их вида. Результаты исследования занесены в таблицу 2.
Таблица 2. Видовой состав иксодофауны Ростовской области
| Виды иксодид | Количество особей | Виды бабезий, передаваемые клещами | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Общее | Самцы | Самки | |||
| абс. | % | абс. | абс. | ||
| Dermacentor marginatus | 3854 | 70.8 | 1348 | 2506 | Babesia canis |
| Dermacentor pictus | 1125 | 20.7 | 294 | 831 | Babesia canis |
| Hyalomma scupense | 86 | 1.6 | 44 | 42 | Theileria sp. |
| Hyalomma detritum | 75 | 1.4 | 31 | 44 | нет данных |
| Rhipicephalus sanguineus | 248 | 4.6 | 114 | 134 | Babesia vogeli |
| Ixodes ricinus | 53 | 0.9 | 28 | 25 | Babesia canis |
Из таблицы видно, что наиболее ожидаемым видом бабезий. распространенным на территории Ростовской области, будет Babesia cams.
Из 100 собак, у которых была отобрана кровь на носительство бабезиоза. у 12 был получен положительный результаты в реакции ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией). Таким образом, носительство бабезиоза в Ростовской области составило 12%. Наибольшее распространение бабезиоз получил среди таких пород как немецкая овчарка, метисы и таксы (табл. 3).
Таблица 3. Распространение носительства бабезиоза по породам собак
| Порода собаки | Номер исследования | Количество животных | Процент, % |
|---|---|---|---|
| Немецкая овчарка | 1.56 | 2 | 16.7 |
| Метис | 7.28 | 2 | 16.7 |
| Такса | 15.39 | 2 | 16.7 |
| Ротвейлер | 10 | 1 | 8.3 |
| Курцхаар | 29 | 1 | 8.3 |
| Русский спаниель | 35 | 1 | 8.3 |
| Лабрадор | 44 | 1 | 8.3 |
| Питбультерьер | 95 | 1 | 8.3 |
| Не указано | 33 | 1 | 8.3 |
Нами были проведены дальнейшие исследования материала положительного на наличие родовых генов к бабезиям. Все 12 положительных материалов были дополнительно исследованы в реакции ПЦР для определения вида возбудителя Из 12 исследованных положительных материалов клинически здоровых животных положительный тест на В. canis оказался у 9 животных, номера исследования - 1. 7 15. 28.29. 33 35. 44. 56. Что составило 9 % от числа всех исследованных животных и 75% от числа всех носителей В 4 случаях тест оказался положительным на В. vogeli номера исследования - 1. 15. 33. 35. Что составило 4 % от числа всех исследованных животных и 33.3 % от числа всех носителей На В rossi все пробы оказались отрицательными При этом все животные, зараженные В. vogeli. были заражены и В. canis Таким образом, в Ростовской области широко распространена микст инвазия В vogeli и В cams.
Вместе с тем, пробы 10 39 95 оказались отрицательными на В. vogeli. В. canis и В. rossi. что указывает, что в Ростовской области распространены не только эти бабезий но и другие виды Мы планируем продолжить исследование и в ближайшее время представить материал о распространении всех видов бабезий на территории Ростовской области
Выводы. Таким образом, на сегодняшний день бабезиоз собак остается важной клинической проблемой, несмотря на серьезные достижения последних лет в понимании патогенеза этого заболевания Остаются нерешенными вопросы передачи инфекции и ее патофизиологический механизм много нерешенных вопросов в диагностике заболевания и терапии этой инвазии открытыми остаются вопросы профилактики данного заболевания
В настоящее время выделены неклассифицированные возбудители заболевания, не до конца выявлен ареал распространения который, по всей видимости, будет продолжать расширяться из-за международного движения собак и расширения ареала клещей.
Носительство бабезиоза у собак в Ростовской области в конце периода передачи инвазии составляет 12%. при этом, инцидентность носительства В canis составляет 9% от числа всех исследованных животных, или 75% от числа носителей, микст инвазия В. canis и В. vogeli составила 4% от числа всех исследованных животных, или 33.3% от числа всех носителей, в 25% случаев идентифицировать вид бабезий не удалось.
Список литературы
Реферат
Бабезиоз (пироплазмоз) собак остается широко распространенным во всем миретрансмисивным гемопротозойным заболеванием. Распространение бабезиоза собак в Ростовской области составило 12%. выявление В. canis - 9% из числа исследованных и 75% из числа носителей, ассоциативное течение В. canis и В. vogeli - 4% от числа исследованных и 33.3% от числа носителей, в 25% случаев пироплазмы не идентифицированы.
Ключевые слова: бабезиоз/пироплазмоз собак, молекулярная таксономия. Babesia spp.. Theileria spp.. Cytauxzoon felis. B. canis canis. B. canis rossi. B. canis vogeli.
Summary
Canine babesiosis/piroplasmosis still remains as a widely spread transmissive haemoprotozoan disease. Distribution babesiosis at dogs in the Rostov area in the end of the period of a transmission of infection makes 12 %. thus, prevalence B. canis makes 9% from number of all investigated animals and 75 %from number of carriers, double infection B. canis and B. vogeli has made 4 % from number of all investigated animals and 33.3 % from number of all carriers, in 25 % of cases to identify a kind of piroplasms not at.
Key words: Canine babesiosis/piroplasmosis. moleculartaxonomy. Babesia spp.. Theileria spp.. Cytauxzoon felis. B. cams canis. B. canis rossi. B. canis vogeli.
Сведения об авторах
Ответственный за переписку с редакцией: Бойко Василий Павлович, соискатель ГНУ СКЗНИВИ. тел. 8-918-431-32-69 г. Новочеркасск, Ростовское шоссе. ГНУ СКЗНИВИ.
Карташов Сергей Николаевич, доктор биологических наук, профессор, зав. лаборатории ГНУ СКЗНИВИ. г. Новочеркасск Ростовское шоссе. ГНУ СКЗНИВИ. 88636227105:
Ключников Александр Геннадьевич, ст.н.с СКЗНИВИ. г. Новочеркасск. Ростовское шоссе ГНУ СКЗНИВИ. 88636227105:
Миронова Людмила Павловна, доктор ветеринарных наук, г.н.с. СКЗНИВИ. г. Новочеркасск Ростовское шоссе. ГНУ СКЗНИВИ. 88636227105:
Ермаков Алексей Михайлович, доктор биологических наук, профессор, зав. лаборатории ГНУ СКЗНИВИ. г. Новочеркасск Ростовское шоссе. ГНУ СКЗНИВИ. 88636227105:
Миронова Анна Анатольевна, доктор ветеринарных наук, зав лаборатории ГНУ СКЗНИВИ. г. Новочеркасск Ростовское шоссе. ГНУ СКЗНИВИ. 88636227105:
Ярошенко Наталья Валерьевна, соискатель ГНУ СКЗНИВИ. г. Новочеркасск. Ростовское шоссе. ГНУ СКЗНИВИ.
http://vetkuban.com/num5_20109.html