УДК 619:639.3.09
DOI 10.33861/2071-8020-2024-4-31-34
Токарева С. Б., Кудинов П. В., Сехина О. В., Романова Н. Н., Щелкунова Ю. П. Филиал по пресноводному рыбному
хозяйству Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский
научноисследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»
Федерального агентства по рыболовству, Московская область
Барышникова Е. И. ООО «НекстБио», г. Москва
Калошкина И. М. государственное казенное учреждение Краснодарского края «Краснодарская станция
по борьбе с болезнями животных», г. Краснодар
Совершенствование диагностических исследований заболеваний рыб является необходимым этапом для успешного развития рыбохозяйственной отрасли. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет добиться значительного сокращения сроков постановки диагноза и быстрой разработки терапевтических мер, что позволяет сократить ущерб, причиненный заболеванием. Диагностика методом ПЦР имеет научное и практическое значение, с его помощью был осуществлен прорыв диагностических исследований заболеваний в медицине [7]. Метод основан на обнаружении и увеличении малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале, является наиболее чувствительным и специфичным для выявления инфекционных агентов [5]. ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ), в отличие от классической реакции ПЦР, практически не дает ложноположительного результата и становится одним из наиболее популярных методов как в клинической диагностике, так и в научных исследованиях [6]. В отечественной ихтиопатологии для диагностики инфекционных заболеваний метод ПЦР-РВ с использованием тест-систем на конкретного возбудителя приобретает особую актуальность. Однако при лабораторной диагностике некоторых возбудителей методом ПЦР невозможно провести дифференциацию между вирулентными и авирулентными штаммами, что может привести к неоднозначным результатам [10,11]. Возбудителями бактериальных инфекций являются вирулентные бактерии, но нередко у рыб из органов выделяются авирулентные штаммы, что характеризует снижение неспецифической резистентности организма, а не прогрессирующие заболевание. В таких случаях, применение для диагностики бактериальных заболеваний у рыб ПЦР-метода требует проведения дополнительных исследований для правильной постановки диагноза, что имеет особую важность в случаях карантинных заболеваний.
Аэромоноз и бактериальная геморрагическая септицемия (БГС) в аквакультуре являются распространенными бактериальными инфекциями, возбудителями которых являются аэромонады [1]. При развитии БГС, кроме аэромонад, которые играют ключевую роль, присутствуют и другие группы бактерий - псевдомонады, аценитобактеры, миксобактерии, шева-неллы и прочие [9].
Заболевания проявляются серозно-геморрагическим воспалением кожных покровов, асцитом, некротическим распадом кожной и мышечной ткани, экзофтальмом, поражением внутренних органов (развитием септического процесса). Возникновение болезни провоцируют нарушения условий выращивания рыбы (травмы, стрессы, неполноценное кормление, пониженный водообмен, переуплотнённые посадки и др.).
Возбудителями являются подвижные аэромонады, относящиеся к роду Aeromonas, семейства Vibrionaceae, грамотрица-тельные короткие (1,2-1,8*0,6 мкм) палочки, с одним полярным жгутиком, оксидазоположительные факультативные аэробы [8].
Классический бактериологический метод диагностики аэ-ромоноза на питательных средах является длительным и трудоемким процессом [3]. Использование диагностики на основе молекулярно-биологических методов позволяет сократить сроки проведения исследований. В связи с широким распространением аэромоноза и БГС при выращивании рыб в аквакультуре и высокой смертностью гидробионтов при замедлении терапии, разработка тест-системы для диагностики методом ПЦР-РВ для выявления ДНК аэромонад является востребованной работой.
В настоящее время в России существуют экспериментальные тест-системы для ПЦР диагностики аэромоноза, но широкого распространения они не получили, и вопрос о разработке коммерческих наборов для диагностики аэромоноза в короткие сроки остается актуальным.
Целью исследований являлась оценка чувствительности нового разработанного набора реагентов для диагностики аэромо-ноза рыб методом ПЦР-РВ.
Материалы и методы исследований. Проведены сравнительные испытания двух методов диагностики аэромноза: ПЦР-РВ с использованием экспериментальной тест-системы и классического бактериологического анализа на питательных средах. Чувствительность методов определяли по проценту положительных проб на аэромонады.
С целью разработки и определения специфичности нового набора для выявления ДНК Aeromonas sp. были отобраны изоля-ты бактерий от рыб разных видов из семейств карповых, лососевых, осетровых и из воды рыбоводных хозяйств и естественных водоемов различных регионов России. Видовой состав микроорганизмов был представлен аэромонадами с различной патогенностью (авирулентные, слабовирулентные, вирулентные, высоковирулентные), бактериями р. р. Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Shewanella, Flavobacterium, Proteus, Citrobacter, Staphylococcus, Enterococcus и бактериями группы кишечной палочки [2].
Выделенные в лаборатории ихтиопатологии Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «ВНИРО» полевые изоляты бактерий послужили уникальным биоматериалом и основой при создании диагностической тест-системы для выявления ДНК аэромонад методом ПЦР «АмплиПрайм® Аэромоноз рыб», разработку которой осуществили специалисты компании ООО «Некст-Био». Оценка эффективности разработанного набора реагентов проведена в условиях лаборатории ихтиопатологии.
В эксперименте использовали сеголетков карпа, средней массой 9,5 г, свободных от бактериальных инфекций. Были сформированы 5 групп рыб по 5 экз. в каждой: 4 опытных группы (в дальнейшем эти группы рыб были заражены аэромонадами (Aeromonas sp.) различной степени патогенности и условно-патогенными бактериями) и 1 контрольная группа (незараженная рыба). Для оценки лабораторной специфичности разработанного набора реагентов проведено заражение рыб различными видами и штаммами аэромонад. Кроме этого, в работе были использованы полевые штаммы (табл. 1).
Таблица 1 Данные по экспериментальным группам рыб и штаммам бактерий, используемых в опыте
| Группы рыб | Бактерии | Количество штаммов бактерий |
|---|---|---|
| Опытная группа №1 | Авирулентные Aeromonas sp. | 8 |
| Опытная группа №2 | Слабовирулетные и вирулентные Aeromonas sp. + условные патогены (Shewanella sp., Acinetobacter sp., Pseudomonas sp., Citrobacter sp.) | 13 |
| Опытная группа №3 | Высоковирулентные Aeromonas sp. | 3,97 |
| (не использовали при отработке праймеров) | 5 | 3,22 |
| Опытная группа №4 | Высоковирулентные Aeromonas sp. | 90,4 |
| (использовали при отработке праймеров) | 5 |
|
| Контрольная группа | Не использовали | - |
Для заражения подопытных рыб использовали смешанные суточные бульонные культуры штаммов, стандартизированные по стандарту мутности бактериальных взвесей ОСО 10 МЕ (концентрация 0,93x109 клеток/мл - для микробов кишечной группы). Заражение проводили внутрибрюшинно, в количестве 0,2 мл/экз. Рыбам контрольной группы вводили внутрибрюшинно 0,2 мл/экз. стерильного питательного бульона.
После заражения рыбу разместили в аквариумах при температуре воды 19-20°С, вели ежедневное наблюдение, отмечали появление клинических признаков и изменения в поведении.
Патологический материал для исследований (печень и почка) отбирали в асептических условиях. Из каждой пробы паренхиматозных органов проводили нативные посевы на агаризованные питательные среды, и эти же пробы органов использовали для ПЦР-тестирования с помощью разработанного набора реагентов.
Патологический материал отбирали после проявления первых признаков заболевания у рыб из опытных групп №№ 1-2 на вторые сутки (на исследования взяты по 2 экз.), оставшиеся экземпляры (3 экз.) исследовали на пятые сутки. У опытных групп №№ 3-4 и рыб группы отрицательного контроля отбор патологического материала у всех рыб проводили на 5 сутки.
Для проведения ПЦР-РВ пробы органов (печень, почка) гомогенизировали в стерильных фарфоровых ступках, затем готовили 10 % суспензию, используя стерильный физиологический раствор или фосфатный буфер. Суспензию переносили в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали при 400 g в течение 2 мин. Надосадочную жидкость использовали для экстракции ДНК. Для выделения нуклеиновой кислоты использовали набор на основе магнитных частиц («МагноПрайм® ВЕТ» - набор реагентов для экстракции ДНК/РНК из биологического материала животных и продуктов питания животного происхождения). Для выявления ДНК аэромонад методом ПЦР-РВ использовали разработанный набор реагентов. Постановку ПЦР проводили на приборе CFX-96 Bio-Rad Laboratories (США). Интерпретацию результатов осуществляли согласно инструкции к разработанному набору «АмплиПрайм® Аэромоноз рыб» (табл. 2). На этапе ПЦР одновременно в одной пробирке проходит амплификация ДНК, синтезированной на матрицах геномной ДНК Aeromonas spp. и ДНК, синтезированной на матрице ДНК внутреннего контрольного образца ВКО В. Результаты амплификации регистрировали по двум различным каналам флуоресцентной детекции (табл. 3).
Таблица 2 Интерпретация результатов для исследуемых образцов
| Результаты (значение порогового цикла (Ct) для приборов роторного / планшетного типов | Интерпретация |
|---|---|
| Значение Ct по каналу для флуорофора R6G определено не выше граничного*. При этом кривая флуоресценции данной пробы по данному каналу пересекает пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции. Значение Ct по каналу для флуорофора Cy5 определено или отсутствует. | ДНК бактерий рода Aeromonas обнаружена |
| Значение Ct по каналу для флуорофора R6G отсутствует, при этом значение Ct по каналу для флуорофора Cy5 определено не выше граничного. | ДНК бактерий рода Aeromonas не обнаружена |
| Значение Ct по каналу для флуорофора R6G отсутствует, при этом значение Ct по каналу для флуорофора Cy5 определено выше граничного или отсутствует. | Невалидный! Сбой ВКО! Требуется повторить анализ |
* Граничные значения Ct указаны в кратком руководстве, прилагаемом к набору.
Таблица 3 Соответствие НК-мишеней и каналов флуоресцентной детекции
| Канал для флуорофора | R6G | Cy5 |
|---|---|---|
| Мишень | ДНК | 8 |
| Aeromonas spp. | ВКО В | 13 |
| Область амплификации | 16S рРНК | искусственно синтезированная последовательность |
При проведении бактериологического анализа посев проб осуществляли на среды: эритритагар и Эндо [4]. Подсчет колоний проводили по их росту на питательных средах: единичный рост -от 1 до 10 КОЕ на чашке, умеренный рост - от 11 до 100 КОЕ на чашке, обильный рост - >100 КОЕ на чашке. Вирулентность выделенных аэромонад определяли на ДНК-тест агаре по ширине зоны деполимеризации ДНК, мм [2].
Результаты исследований и их обсуждение. В экспериментальной работе клинические признаки у незараженных рыб (контрольная группа) отсутствовали. Первые признаки заболевания у рыб опытных групп отмечали на вторые сутки, и проявлялись в виде покраснений рта, кровоизлияний в брюшные плавники и точечные кровоизлияния на теле. На 3-5 сутки отмечали ерошение чешуи, экзофтальм, вздутие брюшка, воспаление ануса, отказ от корма (рисунок 1, 2).
Рис. 1. Клинические признаки аэромоноза - ерошение чешуи
Рис. 2. Клинические признаки аэромоноза - увеличение брюшка, кровоизлияния на поверхности тела
При вскрытии у рыб на 5-е сутки отмечали анемию печени и почек. У рыб, зараженных высоковирулетными аэромонадами, - кровоизлияния в почках, увеличение селезенки. Клинические и патологоанатомические признаки были характерными для аэромоноза.
Результаты сравнительных исследований патологического материала классическим методом на питательных средах и методом ПЦР-РВ с использованием разработанного набора реагентов представлены в таблице 4.
Таблица 4 Результаты сравнения эффективности классического метода бактериологического анализа на питательных средах и метода ПЦР-РВ
| Группа рыб (смешанная культура для заражения) | Результаты тестирования на аэромонады, % положительных «+» проб | |
|---|---|---|
| на питательных средах | ПЦР-РВ | |
| Контроль (незараженные рыбы) | 0 | 0 |
| на 2-е сутки после заражения | ||
| Опытная № 1 (рыбы, зараженные авирулентными аэромонадами) | 100 | 0 |
| Опытная № 2 (рыбы, зараженные аэромонадами с различной ДНКазной активностью + условные патогены*) | 100 | 0 |
| на 5-е сутки после заражения | ||
| Опытная № 1 (рыбы, зараженные авирулентными аэромонадами) | 60 | 100 |
| Опытная № 2 (рыбы, зараженные аэромонадами с различной ДНКазной активностью + условные патогены*) | 33 | 67 |
| Опытная № 3 (рыбы, зараженные высоковирулентными аэромонадами, неиспользованными при подборе праймеров) | 67 | 100 |
| Опытная № 4 (рыбы, зараженные высоковирулентными аэромонадами, используемыми при подборе праймеров) | 75 | 75 |
Примечание: * - условные патогены: Pseudomonas sp., Acinetobacter sp., Moraxella sp., Shewanella sp., БГКП, Citrobacter sp., Staphylococcus sp., Flavobacterium sp.
В паренхиматозных органах (печени, почках) у незаражен-ных рыб аэромонады не были выявлены, что подтверждает специфичность обоих методов.
При проведении диагностики с применением разработанного набора реагентов методом ПЦР-РВ не выявили ДНК аэромонад из органов рыб опытных групп, отобранных на вторые сутки после заражения, тогда как классическим методом выделяли аэромонады во всех исследованных пробах.
При исследовании образцов патологического материала (печень, почки) на 5 сутки после заражения при использовании разработанного набора реагентов методом ПЦР-РВ, аэромонады выявили во всех пробах (100%), отобранных от рыб в группах, зараженных авирулентными и высоковирулентными аэромонадами. При классическом же методе аэромонады выделяли только в 60 и 67% проб соответственно, что свидетельствует о высокой чувствительности тест-системы на пике развития заболевания. Снижение чувствительности бактериологического анализа на питательных средах возможно связано с активизацией фагоцитарного звена иммунной системы у рыб на возбудителя, что привело к снижению его количества в организме.
В группе рыб, зараженных смешанной культурой аэромонад с различной степенью патогенности и условно-патогенных микроорганизмов, частота выявления ДНК аэромонад с помощью тест-системы методом ПЦР-РВ была в 2 раза выше, чем выделение патогена классическим методом. В группе же рыб, зараженных высоковирулентными аэромонадами (использованными при разработке набора реагентов), частота выявления искомого возбудителя была одинакова как в культуральных средах, так и с использованием экспериментальной тест-системы для метода ПЦР-РВ и составляла 75%.
Заключение. Из полученных результатов можно заключить, что на ранних этапах развития аэромоноза для диагностики заболевания предпочтительнее использовать классический бактериологический метод, основанный на посевах на питательные среды. В разгар развития заболевания более эффективной является диагностика с применением разработанного набора реагентов методом ПЦР-РВ на аэромоноз. Необходимо учитывать, что при возникновении заболевания, а также при мониторинге на предприятиях аквакультуры или в естественных водоемах при отборе проб патматериала для исследований будут попадаться особи на разных стадиях развития инфекции, то целесообразнее осуществлять диагностику комплексно - как ПЦР-РВ методом, так и культуральным методом на питательных средах. Обобщение полученных результатов показало, что в период пика развития аэромоноза чувствительность метода ПЦР-РВ существенно выше и составляет 85,5%, тогда как классический бактериологический анализ на питательных средах выявляет возбудителя лишь в 58,8% проб. Недостатком разработанной тест-системы является неизбирательность в отношении эпизоотически значимых, высоковирулентных аэромонад с ДНКазной активностью >5 мм зоны деполимеризации - потенциальных этиологических агентов, поскольку метод выявляет в материале все аэромонады, независимо от степени их патогенности. Аэромоноз является карантинным заболеванием. В вопросе о наложении карантина на рыбоводные хозяйства при обнаружении возбудителя в организме рыб очень большое значение имеет определение патогенности аэромонад. Эти бактерии являются обычными обитателями водной среды, поэтому в некоторых случаях они могут выделяться и от рыбы совершенно здоровой, но с низким уровнем неспецифической резистентности. Таким образом, для экспресс-диагностики аэро-моноза возможно применение ПЦР-метода на аэромонады, при этом на исследование целесообразнее брать рыбу с выраженными клиническими признаками аэромоноза. У рыб без клинических признаков проведение ПЦР-РВ - диагностики должно обязательно сопровождаться дополнительным проведением исследований на питательных средах и дальнейшей оценкой патогенности выделенных аэромонад, во избежание постановки ошибочного диагноза. Полученные результаты исследований послужат основой для актуализации методического обеспечения по диагностике аэромоноза для общероссийской системы региональных центров по охране здоровья объектов аквакультуры.
Список литературы:
1. Басанкина, В. М. Разнообразие и опасность бактерий Aeromonas spp., поражающих рыбу с признаками бактериальной септицемии / В. М. Басанкина, С. В. Пруцаков, Н. Н. Кружнов // Сборник научных трудов: Научные основы повышения продуктивности и здоровья сельскохозяйственных животных. Материалы Международной практической конференции. ФГБНУ «Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии». 2019. Т. 8. № 2. С. 247-251.
2. Инструкция о мероприятиях по борьбе с аэромонозом карповых рыб / Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб. Отдел маркетинга АМБ-Агро. 1998. Ч. 1. С. 142-149.
3. Методы диагностики и идентификации бактерий - возбудителей болезней рыб / Л. Н. Юхименко, А. А. Дружинина, С. Б. Токарева [и др.] // Вопросы рыбного хозяйства Беларуси. 2018. № 34. С. 301-311.
4. Практикум по ихтиопатологии: учебное пособие / Н. А. Головина, Е. В. Авдеева, Е. Б. Евдокимова [и др.] // МОРКНИГА. 2016. 417 с.
5. Рязанцев, Д. Ю. Иммуно-ПЦР: достижения и перспективы / Д. Ю. Рязанцев, Д. В. Воронина, С. К. Завриев // Успехи биологической химии. 2016. T. 56. С. 377-410.
6. Сальникова, Е. А. Преимущества метода ПЦР в реальном времени / Е. А. Сальникова, Е. Е. Тарасова // Сахаровские чтения 2017 года: экологические проблемы XXI века: материалы 17-й международной научной конференции. Республика Беларусь. ИВЦ Минфина. 2017. Ч. 1. С. 213-214.
7. Современные подходы к разработке тест-систем на основе количественной ПЦР в режиме реального времени / М. И. Доронин, Д. В. Миха-лишин, А. В. Спрыгин [и др.] // Ветеринария сегодня. 2023. С. 6-12.
8. Юхименко, Л. Н. Этиологическая структура возбудителей бактериальной геморрагической септицемии рыб / Л. Н. Юхименко, Л. И. Бычкова // Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов - 2 : расширен. материалы Междунар. науч.-практ. конф. Россельхозакадемия. 2007. С. 95-99.
9. Юхименко, Л. Н. Возбудители бактериальной геморрагической септицемии (БГС) рыб, микрофлора воды и комбикормов, имеющая эпидемиологическое значение / Л. Н. Юхименко, Л. И. Бычкова, А. А. Дружинина // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2015. № 26. С. 43-46.
10. Detection of three virulence genes ALT, AHP and AERA in Aeromonas hydrophila and relationship with actual virulence to zebrafish / J. Li, X. Ni, Y. Liu et al. // J. Appl. Microbiol. 2011. P. 823-830.
11. Distribution and virulence gene comparison of Aeromonas strains isolated from diseased fish and water environment / Q. Zhou, Y. Wang, J. Xie et al. // Pol. J. Microbiol. 2013. P. 299-302.
Резюме. В статье представлены результаты оценки чувствительности набора реагентов для диагностики аэромоноза рыб методом ПЦР в режиме «реального времени» в сравнении с классическим бактериологическим анализом на питательных средах при исследовании патологического материала, отобранного от рыб, экспериментально зараженных бактериями рода Aeromonas. На ранних этапах развития заболевания, до развития клинических признаков, диагностика методом ПЦР-РВ с помощью разработанного набора реагентов уступала по чувствительности классическому методу бактериологического анализа на питательных средах. Однако на пике развития заболевания чувствительность метода ПЦР-РВ была выше в сравнении с классическим методом.
Ключевые слова: рыбы, бактериальные болезни, аэромоноз рыб, диагностика, полимеразно-цепная реакция, ПЦР в режиме реального времени.
Сведения об авторах:
Токарева Светлана Борисовна, главный специалист лаборатории ихтиопатологии Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»; 141821, Московская область, Дмитровский г.о., пос. Рыбное, 40 а; e-mail: tokareva@vniiprh.vniro.ru.
Кудинов Павел Владимирович, главный специалист лаборатории ихтиопатологии Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»; 141821, Московская область, Дмитровский г.о., пос. Рыбное, 40 а; e-mail: kudinov@vniiprh.vniro.ru.
Сехина Ольга Васильевна, специалист лаборатории ихтиопатологии Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»; 141821, Московская область, Дмитровский г.о., пос. Рыбное, 40 а; e-mail: sekhina@vniiprh.vniro.ru.
Щелкунова Юлия Петровна, кандидат биологических наук, заместитель заведующего лабораторией ихтиопатологии Филиала по 34 пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»; 141821, Московская область, Дмитровский г.о., пос. Рыбное, 40 а; e-mail: schelkunova@vniiprh.vniro.ru.
Барышникова Елена Ивановна, кандидат биологических наук, старший специалист по разработке новой продукции ООО «НекстБио»; 111394, г. Москва, ул. Полимерная, 8, стр. 2, e-mail: elena-baryshnikova85@yandex.ru.
Калошкина Инна Муратовна, кандидат ветеринарных наук, начальник отдела противопаразитарных, ветеринарно-санитарных мероприятий ГКУ КСББЖ «Краснодарская»; 350004, г. Краснодар, ул. Калинина, 15/1; e-mail: beretarinna@gmail.com.
Ответственный за переписку с редакцией: Романова Наталья Николаевна, кандидат биологических наук, доцент, заведующая лабораторией ихтиопатологии Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»; 141821, Московская область, Дмитровский г.о., пос. Рыбное, 40 а; тел.: 8-495-1086856 (+132); e-mail: romanova@vniiprh.vniro.ru.
http://vetkuban.com/num4_202410.html