УДК 619:616.98:578
DOI 10.33861/2071-8020-2023-4-14-17
Кузьминова Е. В., Сампиев А. М., Семененко М. П., Абрамов А. А. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии», г. Краснодар
К одной из самых серьезных проблем современности относится изменение климата. Продолжающиеся выбросы парниковых газов приводят к усилению глобального потепления, при этом в соответствии с наилучшей
оценкой в смоделированных траекториях выбросов в ближайшем будущем оно достигнет 1,5°C. Так, июль 2023 года уже официально признали самым жарким месяцем за всю историю наблюдений. Каждый прирост глобального потепления будет усиливать множественные и одновременно возникающие опасности для человека и животных. Волны жары (периоды чрезвычайно жаркой погоды, которые длятся несколько дней) во всем мире становятся все более частыми и длятся все дольше, а в Краснодарском крае, который является самым теплым регионом России в летний период температура окружающей среды долго держится на уровне 36-42°С и выше [3, 4, 8, 9, 10].
Потепление климата напрямую влияет на отрасль сельского хозяйства, включая животноводство, поэтому тепловой стресс у животных как результат дисбаланса между притоком тепла из окружающей среды и его выделением организмом относится к наиболее распространенным и экономически значимым проблемам отрасли. К причинам теплового стресса следует отнести высокую температуру воздуха в совокупности с повышенной или, наоборот, очень низкой влажностью, длительное нахождение животных на открытом воздухе во время жары, нагрузки (например, перегоны на значительные расстояния), транспортировка в плохо проветриваемом транспорте. Кроме того, развитию теплового стресса способствует снижение адаптационного потенциала организма при наличии различных заболеваний у животного [2, 7, 12, 13].
Вышеперечисленное диктует необходимость в разработке эффективных ветеринарных препаратов для борьбы с тепловом стрессом у животных.
Учеными ФГБНУ «Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии» осуществлена фармацевтическая разработка препарата для лечения острого теплового стресса у животных, получившего название ревинорм.
Создание высокоэффективного и конкурентоспособного лекарственного препарата - это комплексный многостадийный процесс, состоящий из нескольких этапов. На первом этапе осуществляется поиск фармакологически активных веществ. На следующем этапе - фармацевтическая разработка готовой лекарственной формы на основе выбранных фармакологически активных субстанций, далее - нормирование показателей качества препарата. Потом следует этап доклинических токсикологических исследований, основными задачами которого является определение характера и выраженности повреждающего действия фармакологического средства на организм экспериментальных животных, оценка токсического влияния на органы-мишени, выраженность эффектов, возникающих при взаимодействии фармакологического вещества с живым организмом и др. Полученные данные используют для определения начальной безопасной дозы, диапазона доз для клинических исследований, а также для установления параметров клинического мониторинга потенциальных нежелательных явлений и определения возможности и риска проведения клинических исследований лекарственного препарата [1, 6, 11].
Цель работы - провести нормирование качества и дать оценку безопасности препарата ревинорм.
Материалы и методы исследований. Препарат ревинорм содержит в масс.%: бетаин - 8,0; натрия хлорид - 12,0; калия хлорид - 1,3; полигидроксифенилен - 1,0; натрия салицилат -10,0; натрия бикарбонат - 35,0; аммония сукцинат - 8,0; магния сульфат - 1,2; глюкоза - 23,5.
Влажность препарата ревинорм определяли согласно требованиям общей фармакопейной статьи (ОФС) ОФС 1.2.1.0010.15 «Потеря в массе при высушивании», сыпучесть -по ОФС.1.4.2.0016.15 «Степень сыпучести порошков», pH раствора, полученного растворением препарата в воде - по ОФС 1.2.1.0004.15 «Ионометрия», время растворения (показатель предусмотрен для определения времени растворения из исходных лекарственных форм, требующих перед применением дополнительного преобразования путем растворения в соответствующем растворителе) - по ОФС.1.4.2.0019 «Время растворения или диспергирования», контаминированность микроорганизмами -по ОФС.1.2.4.0002.18 «Микробиологическая чистота», идентификацию - по характерной качественной реакции на салицилат-и-оны, хлорид-ионы в соответствии с ОФС.1.2.2.0001.15 «Общие реакции на подлинность», количественное содержание действующего вещества (по количественно преобладающему в ревинор-ме компоненту) - по ФС.2.2.0011.15 «Натрия гидрокарбонат» [5].
Изучение токсических свойств ревинорма проводилось с использованием методов, представленных в Методических рекомендациях по токсико-экологической оценке лекарственных средств, применяемых в ветеринарии (1998) и Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, изданном под общей редакцией Р.У. Хабриева (2005). Эксперименты на лабораторных животных проведены с соблюдением правил, предусмотренных Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, которые используются с экспериментальной и научной целью (ETS № 123, Страсбург. 18.03.1986).
Острая токсичность препарата изучалась на нелинейных лабораторных крысах при внутрижелудочном способе введения в дозе 7000 мг/кг массы тела или 1480-1500 мг/жив. Количество вводимого препарата рассчитывалось с учетом превышения верхней границы 4 класса опасности для фармакологических веществ (ГОСТ 12.1.007-76), составляющей 5000 мг/кг массы тела животного, поэтому в дизайне эксперимента использовалась доза выше этого значения.
Хроническая токсичность оценивалась на трех группах крыс - двух опытных и одной контрольной (n=10). В течение трех месяцев животные опытных групп индивидуально натощак один раз в сутки получали препарат в форме болюсов в дозах, составляющих 1/10 и 1/20 от максимально введенной дозы в остром эксперименте; контрольная группа - болюсы без действующего вещества в эквиобъеме и в том же режиме дозирования. У пяти животных из каждой группы на 45 и 90 сутки опыта исследовалась кровь на гематологические и биохимические показатели. Взвешивание крыс проводилось в начале опыта и затем каждые 15 дней. Эксперимент завершался эвтаназией пяти крыс из каждой группы с дальнейшим патологоанатомическим вскрытием и гистологическим исследованием извлеченных органов.
Лабораторные исследования крови были проведены при помощи автоматизированных анализаторов - биохимического Vitalab Flexor и гематологического Mythic 18 vet.
Микроструктура внутренних органов изучалась общепринятыми в патогистологии методами. Препараты фиксировались в 10 %-м нейтральном формалине. Парафиновые блоки были микротомированы и окрашены гематоксилином и эозином. Гистологические препараты исследовались и фотографировались при помощи микроскопа «Микромед-3» с видеоокуляром ToupCam 10.0 MP.
Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с помощью программного пакета Statistica 10.0 с определением следующих показателей: М - среднее арифметическое; m -ошибка среднего арифметического; p - значение вероятности.
Результаты исследований и их обсуждение. Ревинорм представляет собой порошок - лекарственную форму, которая относится к недозированным порошкам, для последующего приготовления раствора для приема внутрь. Некоторые физико-химические характеристики и показатели качества разработанного препарата ревинорм представлены в таблице 1.
Ревинорм, согласно приведенным в таблице критериям, обладает оптимальным для порошков параметром сыпучести, приемлемым значением влажности и достаточно однороден, в том числе, с точки зрения равномерной дисперсии частиц активных компонентов и их смешения, а щелочное значение рН получаемого из него по фармакопейной методике раствора соответствует физико-химическим свойствам входящих в состав ингредиентов и целям фармакотерапевтического применения (в частности, по купированию ацидоза при тепловом стрессе и связанных с ним патологических процессов).
Токсикологические исследования в остром опыте показали, что пероральное введение лабораторным крысам ревинорма в дозе 7000 мг/кг массы тела переносится лабораторными животными без токсических последствий, что по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества» позволяет отнести препарат к 4 классу опасности (вещества малоопасные).
В результате хронических токсикологических исследований установлено, что 90-дневное пероральное применение крысам ревинорма не вызывает гибели животных - показатель сохранности по группам был 100%. В течение всего опыта изменений в поведенческих реакциях животных, нарушений двигательной активности и нервно-мышечной возбудимости не установлено. При исследовании шерстного покрова выпадения шерсти, алопеций, изменения цвета и структуры не выявлено. У опытных животных изменения и достоверные различия с интактной группой в показателях ритма дыхания, частоты сердечных сокращений и температуры тела отсутствовали, показатели не выходили за границы видово-возрастной нормы для взрослых здоровых крыс. Отклонений в функциях пищеварения и мочеотделения не отмечено: фекальные болюсы оформлены, коричневатого цвета, нормальной консистенции; отсутствовали изменения в цвете и объеме мочи.
К завершению токсикологического эксперимента у крыс разница в массе тела между опытными группами и контрольными аналогами составила: в 1 опытной группе - 9,9%; во 2 опытной -6,4% в пользу опытных животных.
Возможное токсическое влияние препарата на организм крыс в хроническом опыте оценивалось при лабораторных исследованиях крови. Анализ полученных результатов показал, что все определяемые показатели крови находились в диапазоне референсных значений - патологических сдвигов не выявлено.
Длительное применение крысам ревинорма оказало влияние на протеиновый статус их организма (табл. 2).
Таблица 1 Показатели и нормы качества препарата ревинорм
| № п/п | Показатель качества | Нормируемое значение показателя качества | Метод определения |
|---|---|---|---|
| 1 | Описание | Однородный белый или белый с легким кремовым оттенком порошок | Однородность при рассмотрении невооруженным глазом |
| 2 | Потеря в массе при высушивании | Не более 10 % | Определение проводят согласно ОФС 1.2.1.0010.15 |
| 3 | pH раствора | В пределах 9-10 | Определение проводят согласно ОФС 1.2.1.0004.15 |
| 4 | Сыпучесть | Не более 5,0 г/сек | Испытания проводят по ОФС 1.4.2.0016.15 |
| 5 | Время растворения | Не более 5 минут | Устанавливают по ОФС.1.4.2.0019, растворитель - вода очищенная |
| 6 | Подлинность | Положительная качественная реакция, характерная для салицилатов; Положительная качественная реакция на хлорид-ионы | Испытания проводят в соответствии с методикой ОФС.1.2.2.0001.15 |
| 7 | Количественное определение действующего вещества (по натрию гидрокарбонату) | 35±0,35% | Определение проводят с точной навеской препарата титриметрическим методом согласно ФС.2.2.0011.15 |
| 8 | Микробиологическая чистота | Общее число аэробных микроорганизмов - не более 103 КОЕ в 1 г.; - Общее число дрожжевых и плесневых грибов -не более 102 КОЕ в 1 г.; - Отсутствие Escherichia coli в 1 г | Определение проводят в соответствии с ОФС.1.2.4.0002.18, категория 3А |
Таблица 2 Влияние ревинорма на биохимические показатели лабораторных крыс в хроническом опыте (M±m; n=5)
| Показатели | Группы | ||
|---|---|---|---|
| 1 опытная | 2 опытная | 3 опытная | |
| 45 день исследований | |||
| Общий белок, г/л | 81,2±1,70* | 77,8±2,5 | 75,0±1,36 |
| Мочевина, ммоль/л | 8,04 ±0,14 | 7,90±0,16 | 7,76±0,20 |
| Креатинин, ммоль/л | 42,8±1,92 | 41,6±1,66 | 41,2±1,14 |
| Холестерин, ммоль/л | 1,34±0,11 | 1,26±0,14 | 1,16±0,17 |
| Глюкоза, ммоль/л | 9,70±0,22 | 9,60±0,25 | 9,42±0,18 |
| АлАТ, Ед/л | 43,4±2,38 | 44,6±2,14 | 45,6±1,82 |
| АсАТ, Ед/л | 93,2±2,91 | 91,4±2,84 | 90,2±1,89 |
| Общий билирубин, мкмоль/л | 6,12±0,45 | 6,18±0,20 | 6,16±0,38 |
| Прямой билирубин, мкмоль/л | 1,98±0,17 | 2,08±0,14 | 2,12±0,18 |
| 90 день исследований | |||
| Общий белок, г/л | 82,6±1,09** | 79,2±2,11 | 76,0±1,04 |
| Мочевина, ммоль/л | 8,14 ±0,24 | 7,94±0,20 | 7,82±0,13 |
| Креатинин, ммоль/л | 44,2±2,23 | 42,6±1,38 | 40,8±1,33 |
| Холестерин, ммоль/л | 1,40±0,12 | 1,32±0,12 | 1,18±0,15 |
| Глюкоза, ммоль/л | 9,78±0,23 | 9,64±0,22 | 9,46±0,24 |
| АлАТ, Ед/л | 44,2±1,66 | 45,4±2,29 | 46,8±1,72 |
| АсАТ, Ед/л | 91,8±1,98 | 90,6±1,50 | 89,2±2,40 |
| Общий билирубин, мкмоль/л | 6,10±0,56 | 6,14±0,32 | 6,22±0,26 |
| Прямой билирубин, мкмоль/л | 1,96±0,16 | 2,04±0,20 | 2,10±0,17 |
Примечание: * р<0,05, ** р<0,01 степень достоверности по отношению к контролю
Так, у опытных животных относительно данных контрольной группы концентрация общего белка в крови была выше: на 45 день опыта в 1 группе на 8,3 % (p<0,05) и во 2 - на 3,7 %; на 90 день опыта в 1 группе на 8,7 % (p<0,01) и во 2 - на 4,2 %.
Влияние препарата ревинорм на гематологические показатели проявилось к концу хронического токсикологического эксперимента и привело к повышению у животных 1 опытной группы концентрации эритроцитов на 14,5 % (p<0,05) и гемоглобина на 7,2 % относительно контроля. Во 2 опытной группе эти показатели были выше на 14,3 % (эритроциты) и 9 % (гемоглобин).
При макроскопическом исследовании крыс из опытных групп изменений анатомического строения и топографии внутренних органов установлено не было, что свидетельствует об отсутствии токсического влияния изучаемых препаратов на животных. Шерсть была блестящей, без очагов облысения. Кожа обычной окраски без признаков раздражения. Слизистая оболочка глаз, носовых ходов и ротовой полости бледно-розового цвета, без наложений, прозрачная, влажная. При гистологическом исследовании внутренних органов животных патологических изменений выявлено также не было.
Заключение. Таким образом, для разработанного препарата ревинорм, предназначенного для лечения острого теплового стресса у животных, проведено нормирование показателей качества. На основании проведенных токсикологических исследований установлено, что по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества» ревинорм относится к IV классу опасности (вещества малоопасные), а при длительном применении безвреден для животных.
Список литературы:
1. Бирюкова, Н. П. Общие принципы доклинической оценки безопасности фармакологических лекарственных средств для ветеринарного применения / Н. П. Бирюкова, С. В. Русаков, В. В. Напалкова // Ветеринарный врач. 2018. № 1. С. 3-9.
2. Влияние теплового стресса на коров в сухостойный и послеродовой период / А. И. Белоусов, И. А. Шкуратова, А. С. Красноперов [и др.] // Вестник НГАУ (Новосибирский государственный аграрный университет). 2022. № 3 (64). С. 93-101.
3. Возможные последствия изменения климата на Юге европейской территории России / М. Ч. Залиханов, Л. М. Федченко, Б. А. Ашабоков [и др.] // Успехи современного естествознания. 2021. № 12. С. 107-113.
4. Гладильщикова, А. А. Завершение шестого цикла работы Межправительственной группы экспертов по изменению климата (МГЭИК) : принятие Синтезирующего доклада / А. А. Гладильщикова, Т. М. Дмитриева // Фундаментальная и прикладная климатология. 2023. Т. 9. № 1. С. 5-12.
5. Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV издания https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-14/
6. Дорожкин, В. И. Современные требования к изучению общетоксического действия фармакологических веществ / В. И. Дорожкин, Н. П. Бирюкова, Т. В. Бахмутова // Российский журнал Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. 2019. № 2 (30). С. 205-215.
7. Ковалева, Г. П. Влияние теплового стресса на воспроизводительную способность молочных коров и способ ее коррекции / Г. П. Ковалева, М. Н. Лапина, Н. В. Сулыга // Сельскохозяйственный журнал. 2022. № 2 (15). С. 58-65.
8. Обзор современного состояния и изменений климата РФ / М. Ю. Бардин, Э. Я. Ранькова, Т. В. Платова [и др.] // Использование и охрана природных ресурсов в России. 2020. № 3 (163). С. 69-77.
9. Папикян, К. А. Изменение климата - угроза экологической безопасности / К. А. Папикян, О. В. Корницкая // Студент и наука. 2023. № 1 (24). С. 123-126.
10. Папцов, А. Г. Глобальная продовольственная безопасность в условиях климатических изменений: монография / А. Г. Папцов, Н. А. Шела-мова // РАН. 2018. С. 132.
11. Рахматуллин, Э. К. Изучение токсичности ветеринарных препаратов на доклиническом этапе / Э. К. Рахматуллин, О. Д. Скляров // Вестник российской сельскохозяйственной науки. 2019. № 5. С. 61-64.
12. Состояние биохимического профиля крови и уровня эндогенной интоксикации у коров с гепатопатиями в условиях теплового стресса / Е. В. Кузьминова, Е. Н. Рудь, М. П. Семененко [и др.] // Ветеринария сегодня. 2022. Т. 11. № 2. С. 135-141.
13. Состояние перекисного окисления липидов в организме молочных коров при тепловом стрессе / Е. Н. Рудь, Е. В. Кузьминова, М. П. Семененко [и др.] // Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2021. № 92. С. 238-244.
Резюме. К одной из самых серьезных проблем современности относится изменение климата, которое напрямую влияет на отрасль сельского хозяйства, включая животноводство. Поэтому тепловой стресс у продуктивных животных относится к наиболее распространенным и экономически значимым проблемам отрасли, а разработка эффективных препаратов для борьбы с этой патологией является актуальным направлением ветеринарной фармакологии. Авторами проведено нормирование качества и дана оценка безопасности препарата ревинорм, предназначенного для лечения острого теплового стресса у животных. Нормирование показателей качества препарата проводилось согласно требованиям общих фармакопейных статей Государственной Фармакопеи Российской Федерации XIV издания. Острую токсичность ревинорма изучали на нелинейных лабораторных крысах при внутрижелудочном способе введения в дозе 7000 мг/кг массы тела. Хроническая токсичность оценивалась на трех группах крыс - двух опытных и одной контрольной (n=10). В течение трех месяцев животные опытных групп индивидуально натощак один раз в сутки ы форме болюсов получали препарат в дозах, составляющих 1/10 и 1/20 от максимально введенной дозы в остром эксперименте; контрольная группа - болюсы без действующего вещества в эквиобъеме и в том же режиме дозирования. По результатам работы для препарата ре-винорм проведено нормирование показателей качества. На основании токсикологических исследований установлено, что по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества» ревинорм относится к IV классу опасности (вещества малоопасные), а при длительном пероральном применении безвреден для теплокровных животных.
Ключевые слова: препарат ревинорм, животноводство, продуктивные животные, тепловой стресс, терапия, показатели качества, токсикологическая оценка, ветеринарная фармакология, изменение климата, пероральное применение.
Сведения об авторах:
Кузьминова Елена Васильевна, доктор ветеринарных наук, доцент, главный научный сотрудник отдела фармакологии ФГБНУ «Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии»; 350004, г. Краснодар, ул. 1-я Линия, 1; тел.: 8-918-4198369; е-mail: niva1430@mail.ru.
Сампиев Абдулмуталип Магаметович, доктор фармацевтических наук, профессор, ведущий научный сотрудник отдела фармакологии ФГБНУ «Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии»; 350004, г. Краснодар, ул.1-я Линия, 1; тел: 8-928-0375500; е-mail: sampiev_abdul@mail.ru.
Семененко Марина Петровна, доктор ветеринарных наук, доцент, заведующая отделом фармакологии ФГБНУ «Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии»; 350004, г. Краснодар, ул.1-я Линия, 1; тел.: 8-918-4612663; е-mail: sever291@mail.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Абрамов Андрей Андреевич, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник отдела фармакологии ФГБНУ «Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии»; 350004, г. Краснодар, ул. 1-я Линия, 1; тел.: 8-902-4061527; e-mail: abramov1527@mail.ru.
http://vetkuban.com/num4_202305.html