УДК 619:6152
Красочко П.А., Корочкин Р.Б., Красочко П.П., Понаськов М.А. УО «Витебская ордена «Знак Почета»
государственная академия ветеринарной медицины», Республика Беларусь, г. Витебск
Кощаев А.Г. ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет», г. Краснодар
Черных О.Ю. ГБУ КК «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория», г. Кропоткин
Введение. Резистентность микроорганизмов к антибиотикам является важной проблемой терапии инфекционных болезней животных, так как их широкое применение привело к появлению резистентных штаммов у многих микроорганизмов. Достижения в области нанотехнологий открыли новые возможности в наномедицине, позволив синтезировать наночастицы, которые могут быть основой для конструирования препаратов комплексного состава с антибактериальной активностью. Наночастицы считаются наиболее действенной альтернативой или дополнением антибиотикам, обладая высоким потенциалом для решения проблемы появления бактерий с множественной антибактериальной устойчивостью [7]. С физической точки зрения, наноразмерными являются те частицы, которые имеют, по меньшей мере, один линейный размер в диапазоне от 1 до 100 нм (10-9-107 м). Они являются основным компонентом в дисперсной системе, выступая в роли дисперсной фазы. Имея твердое агрегатное состояние, их совокупность в сочетании с дисперсионной средой жидкого агрегатного состояния формирует коллоидные растворы. При уменьшении размера частиц отношение площади поверхности к занимаемому ими объему значительно возрастает. Как следствие, коллоидные растворы наноразмерных частиц биоэлементов приобретают новые физические, химические и биологические свойства, отличающиеся от свойств грубодисперсных растворов исходного материала.
Коллоидные растворы наноразмерных частиц биоэлементов все чаще находят широкое применение в наномедицине. Высокая антибактериальная активность наноразмерных частиц биоэлементов в отношении морфологически и метаболитически различных микроорганизмов определяется многогранным механизмом действия наночастиц на микроорганизмы [6], хотя многие стороны их антимикробной активности на микроорганизмы остаются не полностью изученными.
Материалы и методы исследований. В опытах по оценке антибактериального действия наночастиц биоэлементов использовали изготавливаемые ЗАО «Концерн «Наноиндустрия» Института нанотехнологий МФК (Российская Федерация) образцы препаратов АдБион-2 и диоксида кремния, для которых проводили оценку ингибирующего действия на рост микроорганизмов различных видов: Klebsiella pneumonia ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enterica subsp. enterica ATCC BAA-2162, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027.
Данные препараты представляют собой концентраты коллоидных растворов наночастиц серебра и диоксида кремния в водном растворителе. Дисперсная фаза данных препаратов представлена нанораз-мерными частицами сферической формы, размер которых лежит в диапазоне 3-16 нм. Их рабочие растворы приготавливают путем разбавления дехлорированной водопроводной (питьевой) водой в соотношении 1:9, в результате чего получается 10%-ный рабочий раствор по средству.
Антибактериальную активность проводили по методике Кирби-Бауэра, также известной как диффузионный метод. В настоящее время отсутствует стандартизированная методика оценки антибактериального действия коллоидных растворов наноразмерных частиц биоэлементов, и большинство исследователей проводят его определение по установлению минимальной ингибирующей концентрации, характеризующейся определенной трудоемкостью. В этой связи мы решили адаптировать стандартную методику определения ингибирующей активности по определению диаметра ингибиции роста, широко применяемой для антибиотиков.
Методика оценки чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу основана на его диффузии в агаровую среду с последующим подавлением микробного роста. Несмотря на то, что данная методика была стандартизирована еще в 1966 году [3], с небольшими изменениями и модификациями она продолжает использоваться до сих пор во многих странах [1, 2].
В качестве питательной среды для оценки ингибирующего действия на-ночастиц биоэлементов использовали агар Мюллера-Хинтона. Данная среда, первоначально разработанная в 1941 году для изоляции микроорганизмов рода Neisseria, в настоящее время рекомендована для рутинного тестирования чувст-вительности нетребовательных микроорганизмов по методике Кирби-Бауэра. Основной причиной широкого использования среды Мюллера-Хинтона в диско-диффузионном методе является присутствие в ней крахмала, обладающего антитоксическим действием, а также равной скоростью диффузии антибактериальных компонентов.
В качестве сравнения для оценки ингибирующего действия коллоидных растворов наноразмерных частиц биоэлементов использовали МПА, в котором осуществляли аналогичную по постановке серию опытов с тестовыми культурами бактерий.
В стандартные 10-сантиметровые чашки Петри разливали по 25 мл приготовленного агара с таким расчетом, чтобы после застывания глубина агарового слоя составляла 4 мм. Считается, что толщина агара определяет точность результатов по чувствительности бактерий, поскольку антимикробное вещество в тонком слое среды будет диффундировать далее в агаровом слое, создавая большие зоны подавления роста. И наоборот, чашки с толщиной среды > 4 мм дают ложные результаты о высокой антибактериальной устойчивости микроорганизмов.
В качестве тестовых микроорганизмов использовали 18-24-часовые бульонные культуры, которые предварительно контролировали по стандарту мутности МакФарланда, доводя их концентрацию до 0,5 единиц, что равняется 1,7 Международным единицам мутности и приблизительно соответствует 1,5*108 микробных клеток кишечной группы в 1 мл. После внесения 1,0 мл бульонной культуры на поверхность агара проводили ее равномерное сплошное распределение по поверхности плотной питательной среды, удаляя излишек жидкости стерильной пастеровской пипеткой. После непродолжительного подсушивания (не более 15 минут) в каждой чашке Петри в толще агара пробивали по 3 отверстия стерильным пробойником диаметром 5 мм по углам воображаемого равностороннего треугольника с таким расчетом, чтобы расстояние между лунками составляло не менее 24 мм.
В приготовленные лунки в толще агара вносили по 0,1 мл исследуемых коллоидных растворов наноразмерных частиц серебра, диоксида кремния и стерильного изотонического раствора, соответственно. В трех сериях опытов использовали коллоидные растворы биоэлементов в неразведенном виде, в раз-ведении 1:10 (рекомендуемое рабочее разведение препарата) и 1:100 (контроль разведения). После внесения исследуемых растворов в лунки агара проводили инкубацию посевов в аэробных условиях при 35°С в течение 18 часов.
Результаты исследований и их обсуждение. По завершению инкубации проводили замер зон ингибиции роста микроорганизмов по их диаметру и кольцевому радиусу, последний из которых не принимал в расчет размер лунки. Результаты опытов представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1 Антибактериальная активность коллоидных растворов наноразмерных частиц биоэлементов по диаметру (кольцевому радиусу без учета размера лунки) зон ингибиции роста микроорганизмов на среде Мюллера-Хинтона (в мм)
| Микроорганизм | АдБион-2 | Коллоидный раствор наноразмерных частиц диоксида кремния | Изотонический раствор (контроль) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| неразв. | 1:10 | 1:100 | неразв. | 1:10 | 1:100 | ||
| Klebsiella pneumonia ATCC 700603 | 14 (4,5) | 12 (3,5) | - (0) | 12 (3,5) | 8 (1,5) | - (0) | - (0) |
| Escherichia coli ATCC 25922 | 14 (4,5) | 11 (3,0) | 7 (1,0) | 10 (2,5) | - (0) | - (0) | - (0) |
| Salmonella enterica ATCC BAA-2162 | 26 (10,5) | 21 (8,0) | 7 (1,0) | 13 (4,0) | 10 (2,5) | - (0) | - (0) |
| Staphylococcus aureus ATCC 6538 | 39 (17,0) | 36 15,5) | 9 (2,0) | 15 (5,0) | 10 (2,5) | - (0) | - (0) |
| Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 | 15 (5,0) | 12 (3,5) | - (0) | 9 (2,0) | - (0) | - (0) | - (0) |
Таблица 2 Антибактериальная активность коллоидных растворов наноразмерных частиц биоэлементов по диаметру (кольцевому радиусу без учета размера лунки) зон ингибиции роста микроорганизмов на среде МПА (в мм)
| Микроорганизм | АдБион-2 | Коллоидный раствор наноразмерных частиц диоксида кремния | Изотонический раствор (контроль) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| неразв. | 1:10 | 1:100 | неразв. | 1:10 | 1:100 | ||
| Klebsiella pneumonia ATCC 700603 | 14 (4,5) | 12 (3,5) | - (0) | 12 (3,5) | 8 (1,5) | - (0) | - (0) |
| Escherichia coli ATCC 25922 | 14 (4,5) | 12 (3,5) | 8 (1,5) | 10 (2,5) | - (0) | - (0) | - (0) |
| Salmonella enterica ATCC BAA-2162 | 28 (12,5) | 21 (8,0) | 8 (1,5) | 13 (4,0) | 10 (2,5) | - (0) | - (0) |
| Staphylococcus aureus ATCC 6538 | 41 (18,0) | 38 (16,5) | 9 (2,0) | 16 (5,5) | 10 (2,5) | - (0) | - (0) |
| Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 | 16 (5,5) | 12 (3,5) | - (0) | 9 (2,0) | - (0) | - (0) | - (0) |
Анализ таблиц 1 и 2 указывает на выраженное антибактериальное действие коллоидного раствора на основе наноразмерных частиц серебра АдБион-2 в отношении всех тестируемых культур как в рекомендуемом рабочем разведении (1:10), так и в исходной концентрации. Следует отметить, что по причине отсутств ия стандартизированной методики оценки антибактериального действия растворов наночастиц по размерам зоны задержек роста микроорганизмов, полученные в нашем опыте зоны ингибиции не дают возможности категоризации степени чувствительности тестовых микроорганизмов к испытуемым растворам наночастиц. В методике Кирби-Бауэра чувствительность микроорганизмов к антибиотикам классифицируется по трем категориям: устойчивые, умеренно устойчивые и чувствительные, причем показатели зон диаметров ингибиции роста бактерий сильно варьируют в зависимости от используемого антибиотика, степени диффузии в агаре, его концентрации в диске и вида микроорганизма. В приблизительной стандартной интерпретации кольцевой радиус задержки роста более 6 мм свидетельствует о чувствительности тестируемого микроорганизма к препарату [5], однако точная оценка результатов в каждом конкретном случае допускает меньшие размеры диаметров зон ингибиции роста (2,5 мм и выше). Исходя из сравнительной оценки диско-диффузионным методом, нами сделан вывод, что все использованные в опыте микроорганизмы оказались чувствительными к препарату АдБион-2, когда использовалось рабочее разведение препарата (1:10), так как зоны ингибиции роста микроорганизма во всех случаях превышали 3,0-3,5 мм по кольцевому радиусу.
Из всех тестируемых микроорганизмов наибольшую чувствительность демонстрировал Staphylococcus aureus ATCC 6538, в отношении которого показатели кольцевых радиусов задержки роста были выше значения 15,5 мм. Чуть меньшую чувствительность имел микроорганизм Salmonella enterica subsp. enterica ATCC BAA-2162 (кольцевой радиус задержки роста 8,0 мм в рабочем разведении), а чувствительность остальных микроорганизмов была приблизительно одинаковой (значения кольцевого радиуса задержки роста в пределах 3,0-3,5 мм). Данный результат несколько противоречит наиболее цитируемому утверждению, что чувствительность грамотрицатель-ных микроорганизмов к наночастицам биоэлементов сравнительно выше, чем у грамположительных [3, 6, 9], так как в нашем случае именно грамположительный микроорганизм (золотистый стафилококк Staphylococcus aureus ATCC 6538) демонстрировал наибольшую чувствительность к антибактериальному действию наноразмерных частиц, особенно при использовании наночастиц серебра. Тем не менее, при испытании коллоидного раствора наноразмерных частиц диоксида кремния разница между чувствительностью грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов не была очевидной. Учитывая, что в опыте использовался только один грамположительный микроорганизм, а остальные четыре принадлежали к числу грамотрицатель-ных, нет оснований утверждать о достоверных различиях в действии препарата AgБион-2 по отношению к различным типам бактерий, так как высокая чувствительность золотистого стафилококка может быть его штаммовой индивидуальной особенностью.
Препарат на основе наноразмерных частиц диоксида кремния демонстрировал меньшую антибактериальную активность по сравнению с препаратом AgБион-2, так как показатели кольцевых радиусов задержки роста находятся в пределах 1,5-4,0 мм, а микроорганизмы Escherichia coli ATCC 25922 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 вообще оказались полностью устойчивыми в разведении 1:10. По утверждению производителя, данный препарат в настоящее время находится в стадии разработки, и его рабочие концентрации нуждаются в уточнении.
Сравнительный анализ антибактериального действия коллоидных растворов наноразмерных частиц в различных разведениях указывает, что, как исходный препарат, так и его рабочее разведение (1:10) демонстрируют высокую антибактериальную активность, что особенно верно для препарата AgБион-2. Как видно из таблицы 1, десятикратное разведение обоих препаратов до рабочего разведения сохраняет высокую антибактериальную активность, причем отсутствует линейная зависимость степени разведения препаратов и показателей размеров зон задержек роста. Это может быть объяснено отсутствием линейной зависимости концентрации наноразмерных частиц в агаре от величины расстояния их диффузного переноса в среде, а ее кривая, по-видимому, имеет характер графика степенной функции.
Наивысшее разведение тестируемых препаратов (1:100) использовалось в качестве возможного отрицательного контроля, и во всех случаях устойчивость тестовых микроорганизмов к данному разведению была высокой или абсолютной. Этот результат указывает, что показатель минимальной ингибирующей концентрации (МИК) для обоих препаратов лежит в пределах разведений от 1:100 до 1:10 по средству, что нам предстоит выяснить в следующих опытах.
Сравнение разницы диметров зон ингибиции роста микроорганизмов на средах Мюллера-Хинтона и МПА указывает на отсутств ие существенных отличий в их показателях. Значения размеров зон задержки роста, имеющие отличия, выделены в таблицах 1 и 2 курсивом, причем во всех случаях разница не превышала 1,0 мм и не являлась достоверной. Одним из основных преимуществ использования среды Мюллера-Хинтона для оценки активности антибиотиков является наличие в ее составе крахмала, оказывающего антитоксический эффект для бактерий. На наш взгляд, данное условие не является обязательным при оценке антибактериального действия коллоидных растворов наноразмерных частиц биоэлементов, так как предполагается, что их активность во многом определяется именно цитотоксичностью [9, 10].
Заключение. Проведенные нами исследования позволяют сделать следующие выводы:
1. Коллоидные растворы наноразмерных частиц серебра и диоксида кремния оказывает выраженное антибактериальное действие в рабочих (1:10) разведениях в отношении всех тестируемых микроорганизмов.
2. Препарат на основе наноразмерных частиц серебра имеет более высокое антибактериальное действие по сравнению с препаратом на основе наночастиц диоксида кремния.
3. Минимальная ингибирующая концентрация наночастиц серебра и диоксида кремния лежит в диапазоне разведений препаратов 1:100 —1:10 и требует дальнейшего уточнения.
4. Использование МПА и среды Мюллера-Хинтона для оценки антибактериального действия методом диффузии в агар дает сравнительно одинаковые результаты.
5. Методика определения антибактериального действия препаратов на основе нано- и коллоидных частиц биоэлементов требует дальнейшей оценки и стандартизации.
Список литературы:
Резюме. В настоящее время нанотехнологии и наноматериалы нашли применение во многих областях жизни и деятельности человека, а наноразмерные частицы серебра представляют особый интерес из-за их антибактериальной активности. В настоящее время появились многие производители препаратов на основе наночастиц биоэлементом, однако рутинные методики лабораторной оценки их антибактериального действия отличаются по своему исполнению. Наночастицы считаются наиболее действенной альтернативой или дополнением к антибиотикам, обладая высоким потенциалом для решения проблемы появления бактерий с множественной антибактериальной устойчивостью. Авторами изучено действие наночастиц биоэлементов, которые производит ЗАО «Концерн «Наноиндустрия» Института нанотехнологий МФК (Российская Фе-дерация) образцы препаратов АдБион-2 и диоксида кремния. Проведена оценка ингибирующего действия данных препаратов на рост микроорганизмов различных видов: Klebsiella pneumonia ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enterica subsp. enterica ATCC BAA-2162, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Авторами показано, что из-за отсутствия стандартизированной методики оценки антибактериального действия растворов наночастиц по размерам зоны задержек роста микроорганизмов, по-лученные в опытах зоны ингибиции не позволяют категоризировать степень чувствительности тестовых микроорганизмов к испытуемым растворам наночастиц. Авторами показано, что из всех тестируемых микроорганизмов наибольшую чувствительность демонстрировал Staphylococcus aureus ATCC 6538, в отношении которого показатели кольцевых радиусов задержки роста были больше 15,5 мм. Кольцевой радиус задержки роста 8,0 мм в рабочем разведении имел микроорганизм Salmonella enterica subsp. enterica ATCC BAA-2162, а чувствительность остальных микроорганизмов была приблизительно одинаковой (в пределах 3,0-3,5 мм). Данный результат противоречит проведенным ранее исследованиям, где показано, что чувствительность грамотрицательных микроорганизмов к наночастицам биоэлементов выше, чем у грамположительных
Ключевые слова: наночастицы, серебро, кремния диоксид, антибактериальная активность, ингибиции роста, тестовые микроорганизмы, антитоксическое действие, категоризация, степень чувствительности.
Сведения об авторах:
Красочко Пётр Альбинович, доктор ветеринарных наук, доктор биологических наук, профессор, академик РАЕН, заведующий кафедрой эпизоотологии и инфекционных болезней УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»; 210026, Республика Беларусь, г. Витебск, ул. 1-я Доватора 7/11
Корочкин Рудольф Борисович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»; 210026, Республика Беларусь, г. Витебск, ул. 1-я Доватора 7/11; e-mail: rudolfvit@mail.ru.
Красочко Павел Петрович, кандидат ветеринарных наук, доцент, старший научный сотрудник УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»; 210026, Республика Беларусь, г. Витебск, ул. 1-я Доватора 7/11.
Понаськов Михаил Александрович, магистр ветеринарных наук, аспирант кафедры эпизоотологии и инфекционных болезней УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»; 210026, Республика Беларусь, г. Витебск, ул. 1-я Доватора 7/11.
Кощаев Андрей Георгиевич, доктор биологических наук, профессор, проректор по научной работе ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-861-2215637; e-mail: koshhaev.a@kubsau.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Черных Олег Юрьевич, доктор ветеринарных наук, директор ГБУ КК «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория»; 352380, Краснодарский край, г. Кропоткин, ул. Красноармейская, 303; тел.: 8-86138-62314; e-mail: gukkvl50@kubanvet.ru.
http://vetkuban.com/num4_201904.html