Экспериментальная апробация методики внесуставной субхондральной туннелизации коленного сустава собак

УДК: [636.7:616.72-018.3-007.245:616.728.3-089.8:611]-092.9

Степанов М.А., Ступина Т.А. ФГБУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и
ортопедия» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России, г. Курган

Введение. Остеоартроз у человека и разных видов живот­ных описывается как характерный комплекс клинических признаков (боль, ограничение движений) и патологических изменений тканей сустава (деструкция хряща, синовит, изменения субхондральной кости и суставной капсулы) [9]. Изучая современную значимость проблемы остеоартрозов, можно сделать вывод о боль­шом распространении этой патологии среди собак и ее актуальности в практике ветеринарного врача. Большинство авторов наиболее час­то отмечают появление первых признаков патологии уже в возрасте от 10 месяцев [2].

Экспериментальные модели были и остаются одним из важных инструментов исследования патогенеза и разработки технологий ле­чения многих заболеваний. В настоящее время для лечения остеоар­троза широко применяют модифицированные методики субхондраль­ной туннелизации [8, 11]. В условиях субхондральной туннелизации биохимическое окружение - биологически активные вещества, обра­зующиеся при некротизации костной стружки, белковые биорегуля­торы костного мозга; биофизические факторы - уровень содержания кислорода, давление, могут иметь существенное влияние на пролифе­рацию, остео- и хондрогенную дифференцировку клеток [3, 8,10].

Цель - апробация методики внесуставной субхондральной тун­нелизации коленного сустава собак с индуцированным остеоартро­зом.

Материал и методы исследования. Исследование выполнялось на 22 беспородных собаках, которым моделировали остеоартроз (ОА) [4, 5]. Через 28 суток после окончания иммобилизации 5 животных выводили из опыта (серия 1). В серии 2 (n=9) после окончания иммо­билизации проводили внесуставное туннелирование субхондральной зоны. Через 1, 3, 6 и 12 месяцев после туннелирования животных вы­водили из опыта. В серии 3 (n=8) туннелизацию не выполняли, собак выводили из опыта в сроки, соответствующие срокам экспериментов серии 2. Содержание животных и оперативные вмешательства прово­дили в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения Российской Федерации к работе экспериментально-биологических клиник (приказ МЗ СССР №755 от 1977 г.) и принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986). Манипуляции, проводимые на живот­ных, рассмотрены и одобрены этическим комитетом «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова».

Методика проведения внесуставной субхондральной тунне­лизации. Внесуставное туннелирование осуществляли в условиях опе­рационной под внутривенным наркозом тиопентала-натрия в дозе 15 мг/кг массы животного. Для туннелирования применяли электродрель и инъекционную иглу диаметром 0,8 мм типа «Рекорд» с металличес­кой канюлей. Туннелирование медиальных мыщелков производили с латеральной стороны конечности, и наоборот латеральных - с меди­альной. Вкол иглы в мягкие ткани до кости осуществляли под углом от 30 до 60° на уровне верхнего края надколенника по направлению к суставным поверхностям не проникая в полость сустава. В каждом мыщелке делали по 4 тоннеля (рисунок 1).

Рис. 1. Схема туннелирования мыщелков бедренной кости

Для рентгенологического исследования применяли рентген-ап­парат фирмы TOSHIBA E-7239X (Япония). Для гистоморфометричес- кого исследования применяли полутонкие эпоксидные срезы сустав­ного хряща с подлежащей субхондральной костью большой площади (до 8 мм2) [7], которые окрашивали метиленовым синим-основным фуксином, с последующим их сравнительным морфометрическим изучением. Изображения микропрепаратов оцифровывали на АПК «ДиаМорф» (Россия, г. Москва) и анализировали в программе «Видео Тест-Мастер-Морфология» (Россия, г. Санкт-Петербург). Определяли толщину суставного хряща (h, мкм), объемную плотность хондроцитов ^хц, в %) в ткани, численную плотность хондроцитов (ЫАхц, мкм-2) и долю (%) пустых лакун (NAпуст лак) и изогенных групп (NAиз. гр) в общем объёме выборки. В качестве контроля морфометрировали суставной хрящ интактных животных (n=5). Цифровой материал ана­лизировали по критериям вариационной и непараметрической ста­тистик в программе AtteStat, версия 1.0 [1] в электронных таблицах Microsoft Excel 97.

Результаты исследований и их обсуждение. Оперативные вме­шательства, осуществляемые на животных, носили малотравматич­ный характер, о чем свидетельствовал легкий послеоперационный период. Иммобилизация коленных суставов в течение 28 суток вы­зывала временную контрактуру, которая разрабатывалась через 14 суток после снятия аппарата. Внесуставная субхондральная туннели- зация не вызывала изменений в общем состоянии животных.

Рентгенологически при моделировании ОА по сравнению с ин- тактным суставом наблюдалось сужение суставной щели, остеопороз метафизов бедренной и большеберцовой костей, очаговый остео­склероз субхондральной зоны, контуры суставных поверхностей име­ли неоднородный рисунок с участками пониженной и повышенной плотности напоминающие перфорацию (рисунок 2).

Рис. 2. Рентгенограммы коленного сустава, боковая проекция: а – до моделирования остеоартроза; б – после моделирования остеоартроза

Через месяц после моделирования ОА у животных серий 2 и 3 признаки остеопороза отсутствовали, но структура костной ткани оп­тически была плотнее в серии 2 (рисунок 3). В серии 3, в некоторых случаях, прослеживался локальный остеосклероз субхондральной зоны (рисунок 3 б).

Рис. 3. Рентгенограммы коленных суставов в боковой проекции через месяц после моделирования остеоартроза: а – серия 2; б – серия 3

Через 3 месяца после моделирования ОА рентгенологически структура костной ткани и суставных поверхностей коленного сустава у собак серий 2 и 3 была однородной без видимых признаков деструктивных процессов. В серии 2 сохранялась повышенная оптическая плотность костной ткани (рисунок 4).

Рис. 4. Рентгенограммы коленных суставов в боковой проекции через 3 месяца после моделирования остеоартроза: а – серия 2; б – серия 3

Через 6 месяцев после моделирования ОА рентгенологически у собак серии 2 признаки остеоартроза не выявлены, контуры мы­щелков четкие, структура костной ткани однородная (рисунок 5 а). В серии 3 рентгенологически в боковой проекции выявлен экзостоз на верхнем крае надколенника размером 1 мм, что свидетельствовало о формировании артроза (рисунок 5 б).

Рис. 5. Рентгенограммы коленных суставов в боковой проекции через 6 месяцев после моделирования остеоартроза: а – серия 2; б – серия 3

Через 1 год после моделирования ОА в серии 2 мыщелки бедренной кости имели однородную структуру, линия субхондральной зоны была четкая. В серии 3 в мыщелках бедренной кости просматривались локальные участки пониженной оптической плотности, линия субхондральной зоны имела нечеткие края (рисунок 6).

Рис. 6. Рентгенограммы коленных суставов в боковой проекции через 1 год после моделирования остеоартроза: а – серия 2; б – серия 3

При гистоморфометрическом исследовании при моделирова­нии ОА (серия 1) в суставном хряще обнаружены очаги разволокне- ния в поверхностной зоне, основная часть хондроцитов этой зоны в состоянии лизиса, нарушена целостность базофильной линии, отмече­ны высокие значения доли пустых лакун и изогенных групп, численная и объемная плотность хондроцитов и толщина хряща достоверно ниже контроля (табл. 1).

Таблица 1. Количественные характеристики суставного хряща мыщелков бедра

Параметры		h (мкм, M±m)	NA хц (M±m)	NA пуст лак (%)	NA^ гр (%)	VV хц (%,M±m)
Контроль		475,5±1,3	6,2±0,56	13,6	14,5	9,03±0,46
Серия 1		318,6±2,7	5,3±0,3	43,39	23,8	4,62±0,36
1 месяц	Серия 2	366,17±2,52!	7,31±0,52!	23,6	13,3	5,77±0,33!
	Серия 3	510,9±1,8*!	6,4±0,62*!	35,7	16,1	5,41±0,38!
3	Серия 2	410,48±9,35!	6,51±0,42!	22,3	12,3	6,64±0,27!
месяца	Серия 3	326,6±6,3*	8,6±0,6*!	40,3	8,9	6,19±0,35*!
6	Серия 2	412,59±4,78!	7,67±0,55!	22,1	7,43	5,93±0,39!
месяцев	Серия 3	375,78±8,24*!	10,97±0,95*!	26,2	35,5	4,74±0,27*
12	Серия 2	423,86±0,09!	8,22±0,75!	16,14	15,1	6,96±0,99!
месяцев	Серия 3	306,86±0,99*	8,75±1,36!	27,08	4,8	4,77±0,41*

Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные отличия серии 1 с контролем, ! – между 1 серией с сериями 2 и 3, * – между сериями 2 и 3.

В туннелированных суставах (серия 2) через 1 месяц после мо­делирования ОА в суставном хряще разволокнена лишь суперфици- альная часть поверхностной зоны, целостность базофильной линии не нарушена. Как и в серии 1 в поверхностной зоне часть хондроцитов находилась в состоянии лизиса, отмечены пустые лакуны (рисунок 7 а). В промежуточной и глубокой зонах преобладали функционально ак­тивные хондроциты, такие клетки увеличены в размерах, имели свет­лые гомогенные ядра, базофильную цтоплазму. Значения параметров численной, объемной плотности хондроцитов и толщины хряща досто­верно превышали таковые в серии 1, но не достигали значений конт­роля. По сравнению с серией 1 отмечено снижение доли пустых лакун и изогенных групп в общем объеме выборки.

Через 3 и 6 месяцев после моделирования ОА в суставном хря­ще сохранялось нарушение гомогенности межклеточного вещества верхней суперфициальной части поверхностной зоны, хондроциты этой зоны округлой формы, увеличены в размерах, без признаков деструкции (рисунок 7 б, в). Выявлено достоверное увеличение тол­щины хряща относительно серии 1.

Рис. 7. Суставной хрящ мыщелков бедра. Серия 2. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим и основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5×. Через 1 месяц (а), 3 месяца (б), 6 месяцев (в) и 12 месяцев (г) после моделирования остеоартроза.

Изогенные группы встречались редко. Относительно предыду­щего срока эксперимента в срок 3 месяца после моделирования ОА численная плотность была снижена, но за счет увеличения размеров хондроцитов их объемная плотность увеличивалась. Через 6 месяцев после моделирования ОА незначительное снижение объемной плот­ности относительно предыдущего срока обусловлено достоверным увеличением толщины хряща. Почти в 2 раза по сравнению с серией 1 снижена доля пустых лакун в общем объеме выборки.

Через 1 год после моделирования ОА репаративные процессы преобладали над деструктивными, межклеточное вещество поверх­ностной зоны было гомогенным, очаги разволокнения не выявлены (рисунок 7 г), целостность базофильной линии не нарушена. Морфо­метрически отмечено увеличение объемной плотности хондроцитов по сравнению с предыдущим сроком эксперимента и с серией 1. Увеличение данного параметра было обусловлено как увеличением численной плотности клеток, так и увеличением размеров хондроци- тов. По сравнению с серией 1 существенно снижены значения доли пустых лакун, увеличена доля изогенных групп клеток. Толщина хряща продолжала увеличиваться и достоверно превышала значения серии 1.

В нетуннелированных суставах (серия 3) на всех срока экспе­римента в суставном хряще выявлены деструктивные изменения, наблюдалось разволокнение межклеточного вещества со снижением интенсивности его окраски, большая часть хондроцитов находилась в состоянии деструкции (рисунок 8 а, б, в, г). В промежуточной зоне вы­явлены бесклеточные поля, в глубокой зоне отсутствовало колончатое расположение клеток. В срок 1 месяц после моделирования ОА выяв­лено достоверное увеличение толщины хряща за счет разволокнения и набухания основного вещества поверхностной зоны. Выраженность признаков регенерации была незначительной, с увеличением срока эксперимента деструктивные изменения прогрессировали. В отда­ленный срок эксперимента - через 12 месяцев после моделирова­ния ОА отмечено нарушение цитоархитектоники, демаскировка колла­геновых волокон (рисунок 8 г), нарушение целостности базофильной линии, проникновение сосудов в хрящ.

На всех сроках эксперимента относительно серии 2 сниже­ны параметры - толщина хряща, объемная плотность хондроцитов. Увеличение доли пустых лакун на фоне подавленной пролиферации свидетельствовало о срыве компенсаторных возможностей хряща. Закономерным выглядело достоверное (p<0,001) снижение толщины хряща (табл. 1).

Таким образом, выбранная модель воспроизводит основные рентгенологические признаки остеоартроза; сужение суставной щели, остеопороз дистального метафиза бедренной кости, очаговый остео- 26 склероз субхондральной зоны. Туннелизация субхондральной зоны вы­зывает более ранние рентгенологические признаки восстановления плотности костной ткани мыщелков бедренной кости. Выявленные гистологические изменения суставного хряща при индуцированном в эксперименте ОА соответствовали начальным стадиям ОА - степень 1-3 по гистологической классификации Международного общества изучения остеоартроза OARSI, 2006 [12]. В проведенных нами ранее исследованиях [4, 6] показано, что при данном патологическом про­цессе собственные регенераторные возможности суставного хряща подавлены, и его восстановление невозможно без дальнейшего по­тенцирования внешних по отношению к хрящу механизмов.

Рис. 8. Суставной хрящ мыщелков бедра. Серия 3. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим и основным фуксином. Об. – 40; ок. – 12,5×. Через 1 месяц (а), 3 месяца (б), 6 месяцев (в) и 12 месяцев (г) после моделирования ОА.

Особенностью методики внесуставной субхондральной тунне- лизации является ее малотравматичность, сустав не вскрывается, не нарушается синовиальная среда сустава. В туннелированных суста­вах гистологически выявлены отчетливые признаки торможения раз­рушения суставного хряща. Массовая гибель хондроцитов и деструк­ция матрикса компенсировались быстрой репопуляцией клеточного состава и активизацией синтеза компонентов межклеточного матрик­са, в результате увеличивались количество и размеры хондроцитов, нормализовалась структура матрикса, восстанавливалась толщина хряща. Рентгенологический и гистоморфометрический методы оцен­ки позволили установить, что внесуставная субхондральная туннели­зация оказывает стимулирующее действие на репаративную регене­рацию хрящевой ткани, тем самым замедляет разрушение хрящевой ткани суставов.

В нетуннелированных суставах с увеличением срока экспери­мента отмечен нарастающий артроз. Выраженность признаков реге­нерации суставного хряща была незначительной, с увеличением сро­ка эксперимента деструктивные изменения прогрессировали.

Заключение. На основании полученных результатов, методику внесуставной субхондральной туннелизации можно рассматривать как перспективную в плане стимуляции репаративной регенерации хряща. Проведенное исследование подтвердило эффективность при­менения данной технологии в лечении остеоартроза.

Список литературы.

1. Гайдышев И.П. Анализ и обработка данных: специальный справоч­ник / И.П. Гайдышев. - СПб.: Питер, 2001. - 752 с.
2. Давыдов В.Б. Остеоартрозы у собак: аспекты этиологии, патогенеза, диф. диагноза и лечения / В.Б. Давыдов // Режим доступа: http://www.allvet ru/articles/oa_dog.php
3. Маланин Д.А. Экспериментальные аспекты изучения хондрогенно- го потенциала мезенхимальных плюрипотентных и малодифференцированных клеток, «культивированных» in vivo / Д.А. Маланин, В.Б. Писарев, В.Г Шилов, Г.Л. Снигур, Л.Л. Черезов, Р.А. Михайлов, И.В. Деревянко // Гений ортопедии. - 2002. - №1. - С. 90-97.
4. Макушин В.Д. Экспериментальное моделирование остеоартроза коленного сустава у собак / В.Д. Макушин, М.А. Степанов, Т.А. Ступина // Био­ медицина. - 2012. - №3. - С.108-115.
5. Патент 2452999 Р.Ф, МПК Способ моделирования остеоартроза ко­ленного сустава / Макушин В.Д. (РФ), Степанов М.А. (РФ), Ступина Т.А. (РФ), РНЦ «ВТО» им. акад. ГА. Илизарова (РФ). - №2011104885/14; Заявл. 09.02.2011.; Опубл. 10.06.2012. Бюл.№16.
6. Ступина Т.А. Структурная реорганизация основных компонентов сустава при экспериментальном моделировании остеоартроза с редуцирован­ным кровоснабжением / Т.А. Ступина, Н.А. Щудло, М.А. Степанов // Морфоло­гия. - 2014. - Т.146. - №5. - С.61-68.
7. Ступина Т.А. Способ изготовления препаратов недекальцинирован- ного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью для многоцелевых исследований / Т.А. Ступина, М.М. Щудло // Бюллетень экспериментальной био­логии и медицины. - 2014. - №3. - С.388-390.
8. Chevrier A. Temporal and spatial modulation of chondrogenic foci in subchondral microdrill holes by chitosan-glycerol phosphate/blood implants. / A. Chevrier, C.D. Hoemann, J. Sun, M.D. Buschmann // Osteoarthritis and Cartilage. 2011. - Vol. 19(1). - Р. 136-144.
9. Little C.B. What constitutes an «animal model of osteoarthritis» - the need for consensus? / C.B. Little, S. Zaki // Osteoarthritis and Cartilage. - 2012. V.20. - Р. 261-267.
10. Newman A.P. Articular Cartilage Repair. Current concept / A.P. Newman // American J. of Sports Med. - 1998. - 26(2). - P. 309-324.
11. Mrosek E.H. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: an immunohistochemical analysis in a canine model / E.H. Mrosek, A. Lahm, C. Erggelet, M. Uhl, H. Kurz, B. Eissner, J.C. Schagemann // Osteoarthritis Cartilage. - 2006. - Vol.14(2). - Р. 171-8.
12. Pritzker K.P.H. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging / Pritzker K.P.H., Gay S., Jimenez S.A., Ostergaard K., Pelletier J.P., Revell P.A., Salter D., Path F.R.C., Berg W.B. // Osteoarthritis and Cartilage. - 2006. - V.14. Р. 13-29.

Резюме. В эксперименте проведена апробация методики внесуставной субхондральной туннелизации коленного сустава собак с индуцированным ос­теоартрозом. Исследование выполнялось на 22 беспородных собаках, которым путем иммобилизации обоих коленных суставов с пересечением бедренной артерии моделировали остеоартроз. Через 28 суток после окончания иммоби­лизации 5 животных выводили из опыта (серия 1). В серии 2 (n=9) после оконча­ния иммобилизации проводили туннелирование субхондральной зоны. Через 1, 3, 6 и 12 месяцев после туннелирования животных выводили из опыта. В серии 3 (n=8) туннелизацию не выполняли, собак выводили из опыта в сроки, соот­ветствующие срокам экспериментов серии 2. Эффективность методики внесус- тавной субхондральной туннелизации оценивали с помощью рентгенологичес­кого и гистоморфометрического исследования. Установлено, что внесуставная туннелизация субхондральной зоны вызывает более ранние рентгенологичес­кие признаки восстановления плотности костной ткани мыщелков бедренной кости и оказывает стимулирующее действие на репаративную регенерацию суставного хряща. В серии 2 выявлены отчетливые признаки торможения раз­рушения суставного хряща, по сравнению с серией 1 отмечено увеличение объемной плотности хондроцитов, существенно снижены значения доли пустых лакун, увеличена доля изогенных групп клеток, толщина хряща увеличивалась и достоверно (р<0,001) превышала значения серии 1. В серии 3 на всех срока эксперимента в суставном хряще выявлены деструктивные изменения, относи­тельно серии 2 снижены параметры - толщина хряща, объемная плотность хон- дроцитов, увеличение доли пустых лакун на фоне подавленной пролиферации свидетельствовало о срыве компенсаторных возможностей хряща. Закономер­ным выглядело снижение (p<0,001) толщины хряща. Выявлено стимулирующее действие внесуставной субхондральной туннелизации на репаративную реге­нерацию хрящевой ткани. Проведенное исследование подтвердило эффектив­ность применения данной методики в лечении остеоартроза.

Ключевые слова: собака, остеоартроз, суставной хрящ, субхондральная кость, туннелизация, гистоморфометрия, хондроцит, пролиферация, репаратив- ная регенерация.

Сведения об авторах

Степанов Михаил Александрович, кандидат ветеринарных наук, веду­щий научный сотрудник лаборатории гнойной остеологии и замещения де­фектов ФГБУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. ГА. Илизарова» Минздрава России; 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6; тел.: 8-3522-415227; е-mail: m-stepanov@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Ступина Татьяна Анатоль­евна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории морфологии ФГБУ «Российский научный центр «Восстановительная травма­тология и ортопедия» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России; 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6; тел.: 8-3522-415227; e-mail: stupinasta@mail.ru.

http://vetkuban.com/num4_201708.html