Кощаев А. Г., Мигина Е. И., Лысенко Ю. А. ФГБОУ ВПО "Кубанский государственный аграрный университет", г. Краснодар
Введение. Выращивание здоровой и высокопродуктивной птицы является одной из главных задач для достижения продовольственной биобезопасности РФ [1, 2, 3, 4, 11, 12. 13, 14, 19, 22, 23, 24]. Одним из факторов, сдерживающих развитие отрасли птицеводства, в частности, перепеловодства являются желудочно-кишечные заболевания, которые, в первую очередь, вызваны дисбактериозами [7, 10]. Основной путь в профилактике данных болезней - использование естественных и биобезопасных препаратов и добавок на основе живой микрофлоры [2, 6, 8, 26, 28, 30].
Мировой опыт свидетельствует, что в решении этих проблем все большее значение приобретает использование пробиотиков [1, 2, 3, 4, 8, 15, 27, 29]. Вытесняя из кишечного тракта патогенную микрофлору, они не влияют на представителей естественного биоценоза, способствуют нормализации процессов пищеварения и перевариванию комбикормов [2, 5, 8, 20, 27, 28, 30].
Используемые на ранних стадиях развития пробиотические добавки способствуют заселению желудочно-кишечного тракта полезной симбионтной микрофлорой. Поэтому, возможность создания благоприятного микробного фона в пищеварительном тракте с помощью пробиотиков и рационального кормления представляется важным моментом для повышения здоровья птицы [1, 3, 5, 16, 18, 19, 22, 26].
В последнее время появляются новые отечественные пробиотические добавки и препараты, которые требуют детального изучения и внедрения в производство [11, 12, 16, 21, 22, 29]. В связи с этим, целью наших исследований явилось изучение в лабораторных условиях токсикологического и раздражающего действия новой пробиотической кормовой добавки Трилактосорб.
Материал и методика. Опыты проводили в виварии факультета ветеринарной медицины, на кафедре биотехнологии, биохимии и биофизики Кубанского государственного аграрного университета и лаборатории Краснодарского НИВИ.
В экспериментах использовали новую пробиотическую кормовую добавку Трилактосорб, обладающая антитоксическими свойствами и представляющая собой смесь термофильных молочнокислых культур (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbru0ckii subsp. Bulgaricus, Lactobacillus acidophilus), выращенных на соевом растительном сырье с использованием сорбирующего горно-минерального компонента. Культуры микроорганизмов получены в ГНУ ВНИИМИ (г. Москва).
Токсикологическая оценка пробиотической кормовой добавки Трилакто-сорб изучалась экспресс-методом на стилонихиях (ГОСТ Р 52337-2005), а также путем определения параметров острой токсичности на мышах и крысах (ГОСТ Р ИСО 10993-11-2009). Кож-но-резорбтивное действие и раздражающее свойство на слизистые оболочки глаз изучали на кроликах - альбиносах согласно ГОСТ Р ИСО 10993.10-99. В качестве дополнительного исследования раздражающего действия изучали влияние пробиотической добавки Трилакто-сорб на слизистую ротовой полости хомячков (ГОСТ Р ИСО 10993.1099).
В эксперименте было использовано 82 лабораторных животных (30 мышей, 30 крыс, 4 кролика-альбиноса и 18 хомячков), которых перед началом исследований выдерживали в течение 5 дней для акклиматизации.
Лабораторные животные находились в стандартных условиях вивария, имели свободный доступ к воде, нормальный температурный и световой режимы, содержались клетках с древесной стружкой в качестве подстилки и получали лабораторный гранулированный корм ПК 120-3.
Результаты исследований. Токсикологическую оценку пробиотической кормовой добавки Трилактосорб экспресс-методом осуществляли на суточной культуре стилонихий (Stylonychia mytilus) за 1,5-3 ч, находящейся в стадии экспоненциального роста, путем воздействия на них различных фракций токсических веществ, извлеченных из исследуемой добавки водным и ацетоновым экстрактами. Результат биотестирования оценивали по количеству погибших простейших. Безопасным следует считать добавку, в которой 70-100% особи сохранили жизнеспособность при одновременном параллельном исследовании как ацетонового, так и водного экстракта. На начало опыта в каждой лунке было от 15 до 20 шт. инфузорий. В качестве контроля использовали 1%-й раствор ацетона (1%-й РА) и минеральный раствор Лозина-Лозинского (МР ЛЛ).
Выживаемость стилонихий N (%) вычисляли по формуле:
N = N2 : Ni * 100, где N2 - среднеарифметическое (из пяти испытаний) значение количества сти-лонихий в конце опыта, шт.; N1 - среднеарифметическое (из пяти испытаний) значение количества стилонихий в начале опыта, шт.; 100 - перевод результата в проценты.
Результаты экспресс-метода на инфузориях представлены в таблице 1.
Таблица 1. Токсикологическая оценка пробиотической кормовой добавки Трилактосорб экспресс-методом на инфузориях
Показатель | Опыт | Повторности, кол. | N, % | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||
Контроль (МР ЛЛ) | N, | 19,0 | 20,0 | 18,0 | 17,0 | 19,0 | 100,0 |
N, | 19,0 | 20,0 | 18,0 | 17,0 | 19,0 | ||
Контроль (1%-й РА) | N, | 20,0 | 16,0 | 17,0 | 20,0 | 20,0 | 100,0 |
N, | 20,0 | 16,0 | 17,0 | 20,0 | 20,0 | ||
Водный экстракт Трилактосорба | N, | 19,0 | 19,0 | 17,0 | 19,0 | 20,0 | 97,8 |
N2 | 19,0 | 19,0 | 16,0 | 19,0 | 19,0 | ||
Ацетоновый экстракт Трилактосорба | N1 | 20,0 | 20,0 | 19,0 | 17,0 | 19,0 | 94,7 |
N2 | 18,0 | 18,0 | 19,0 | 17,0 | 18,0 |
Результаты эксресс-оценки показали, что выживаемость стилонихий при действии на них водного и ацетонового экстрактов пробиотической кормовой добавки Трилактосорб, соответственно, составила 97,8 и 94,7 %, что, согласно ГОСТ Р 52337-2005, находится в пределах, характеризующих её как малотоксичную добавку растительного происхождения.
Оценку острой токсичности осуществляли на клинически здоровых беспородных белых мышах с начальной массой тела 20-25 г (возраст 2.5-3.0 мес.) и половозрелых беспородных белых крысах с массой тела 220-250 г (возраст 2.5-3.0 мес.) путем однократного применения пробиотической кормовой добавки Трилактосорб в смеси с кормов лабораторным животным натощак. В эксперименте методом групп-аналогов было сформировано по пять групп животных обоего пола 6 особей в каждой. Согласно научной литературы эффективная доза, характерная для данной группы фармакологических добавок составляет 0,2 % от массы корма [5, 6, 8, 9, 16, 17, 18, 20. 21, 25]. В связи с чем, нами было испытано 3 дозы пробиотической кормовой добавки Трилактосорб от научно-предполагаемой: 3- (0,6%),
(1,0%) и 10-кратные (2,0%). В качестве группконтроля использовались: отрицательный контроль (ОК) - мыши и крысы получали только стандартный лабораторный гранулированный корм ПК 120-3 и контроль модельной среды (КМС), в которой лабораторные животные
употребляли стандартный комбикорм и субстрат, входящий в состав пробиотической кормовой добавки Трилактосорб, в 10-кратной дозе (2,0 %). Наблюдение проводили в течение 14 дней с учетом изменения общего состояния, а также поведения подопытных лабораторных мышей и крыс.
Результаты острой токсичности пробиотической кормовой добавки Трилактосорб на подопытных животных представлены в таблице 2.
Таблица 2. Острая токсичность пробиотической кормовой добавки Трилактосорб на лабораторных животных, (n=6)
Группа | Вид животного | Условия кормления | Результат испытаний, гол. | ||
---|---|---|---|---|---|
заболело | пало | выжило | |||
КО | мыши | ПК 120-3 | 0 | 0 | 6 |
крысы | |||||
КМС | мыши | ПК 120-3 + 2,0 % субстрата | 0 | 0 | 6 |
крысы | |||||
1-я опытная | мыши | ПК 120-3 + 0,6 % Трилактосорб | 0 | 0 | 6 |
крысы | |||||
2-я опытная | мыши | ПК 120-3 + 1,0 % Трилактосорб | 0 | 0 | 6 |
крысы | |||||
3-я опытная | мыши | ПК 120-3 + 2,0 % Трилактосорб | 0 | 0 | 6 |
крысы |
Из таблицы 2 видно, что однократное пероральное использование исследуемых доз пробиотической кормовой добавки Трилактосорб не вызывает гибели лабораторных животных за весь период наблюдения. Состояние подопытных мышей и крыс оставалось удовлетворительным, с хорошо выраженным аппетитом, животные были подвижны, реакция на внешние раздражители оставалась такой же как и до употребления добавки. Нарушения в функциональной активности органов пищеварительной и мочевыделительной систем, а также проявление других токсических явлений - отсутствовали.
По результатам изучения острой токсичности пробиотической кормовой добавки Трилактосорб можно сделать заключение о том, что определить полулетальную дозу (ЛД50) не удалось. Таким образом, учитывая то, что использование пробиотической кормовой добавки Трилактосорб переносится подопытными животными без каких-либо видимых последствий в максимально используемой дозе, её можно отнести как малотоксичным препаратам данной фармакологической группы.
Свободное пероральное использование пробиотических добавок с кормом сельскохозяйственной птицей, в том числе перепелами в производстве, предполагает возможное их попадание на кожу а также слизистые оболочки глаз, что может вызывать негативное воздействие на организм. В результате чего, нами изучалось раздражающее свойство пробиотической кормовой добавки Трилактосорб на кожу и конъюнктиву глаз.
Изучение кожно-резорбтивного действия испытуемой добавки проводили на 2-х половозрелых кроликах-альбиносах обоего пола массой 2,2-2,5 кг, которым за сутки до проведения опыта выстригали шерсть на симметричных участках обоих боков для аппликации, одна из которых служила контролем. Размер обрабатываемой поверхности кожи составлял от 5 до 8% поверхности тела подопытного животного. 1,0 г пробиотическую кормовую добавку Трилактосорб разводили небольшим объемом воды, затем смачивали ватным тампоном и наносили на участок кожи, а сверху фиксировали повязкой. Местно-раздражающее действие Трилактосорба на кожу оценивалась после 4-х часовой экспозицией, а также через 24, 48 и 72 часов. Обращали внимание на степень кожного проявления (покраснение, повышение чувствительности, припухлость, воспаление), включая эритему и отек. а также возможность появления общей реакции организма кроликов-альбиносов.
Результаты накожных аппликаций показали, что в ходе эксперимента у лабораторных животных местного покраснения не отмечалось, отсутствовали повышение чувствительности, припухлость, воспаление, образование эритемы и отек кожи. Таким образом, индекс первичного раздражения пробиотической кормовой добавки Трилактосорб равнялся нулю.
Оценка раздражающего действия Трилактосорба на конъюнктиву глаз проводилась на 2-х половозрелых кроликах-альбиносах обоего пола массой 2.8-3.0 кг. Перед началом опыта, для выявления выраженных повреждений, обращали внимание на состояние глаз каждого подопытного животного. Эксперимент начинали с того, что кроликам-альбиносам аккуратно в нижний отдел конъюнктивального мешка левого глаза вводили такое количество добавки, которое занимает объем 0,1 мл. После инсоляции нижнее и верхнее веки соединяли и в таком положении выдерживали в течение 2-3 сек. Правый глаз служил контролем. Обследование глаза лабораторных животных после введения пробиотической кормовой добавки Трилактосорб проводили через 1, 24, 48 и 72 часа. Обращали внимание на состояние конъюнктивы, роговицы, радужной оболочки, проявление хематоза (отек конъюнктивы), а также наличие выделений из глаза.
Результаты исследований показали, что введение пробиотической кормовой добавки Трилактосорб в нижний отдел конъюнктивального мешка левого глаза вызывает незначительное покраснение слизистой оболочки и выделение слезных желез сразу после инсоляции, которые исчезали через несколько минут. Дальнейшие наблюдения за кроликами не выявили иной патологии: не отмечалось помутнения роговицы глаза, радужная оболочка была без видимых изменений, хематоз и выделения из глаз отсутствовали. Общее состояние кроликов-альбиносов на всех этапах исследований оставалось удовлетворительным, без изменений.
Изучение дополнительного раздражающего действия пробиотической кормовой добавки Трилактосорб на слизистую ротовой полости проводили на здоровых половозрелых хомячках обоего пола массой 230-250 г. из которых формировали три группы подопытных животных по 6 голов в каждой, получавших разные дозы добавки. Пробиотическую кормовую добавку Трилактосорб в дозе 0,6; 1,0 и 2,0 г разводили в 10,0 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия, затем ими пропитывали ватно-марлевые тампоны. Далее помещали их в один защечный мешок каждого лабораторного животного, а другой мешок служил контролем. Продолжительность контакта слизистой рта с материалов составила десять минут. Для предотвращения выталкивания тампона изо рта на каждого хомячка надевали бумажный воротник, располагающийся вокруг шеи так, чтобы не мешать нормальному питанию и дыханию. В конце эксперимента отчет включал в себя макроскопическое исследование защечных мешков сразу после извлечения тампонов, а также оценку состояния слизистой и степень раздражающей реакции.
Проведенный анализ исследований выявил следующую клиническую картину лабораторных животных: слизистая защечного мешка с обеих сторон во всех опытных группах хомячков была чистой, без покраснений, припухлостей, образование отеков и эритем зарегистрировано не было, состояние животных до и после эксперимента не изменилось. Таким образом, индекс раздражающего действия Трилактосорба можно оценить как нулевой, что свидетельствует об отсутствии данного явления на слизистую ротовой полости исследуемой пробиотической кормовой добавки.
Выводы. Комплекс проведенный исследований по изучению токсикологического и раздражающего действия новой пробиотической кормовой добавки Трилактосорб свидетельствует о том, что разработанная добавка не вызывает гибели простейших организмов и лабораторных животных, не проявляет раздражающего действия на кожу, слизистую глаз и ротовой полости, что, в целом, её характеризует как безопасную кормовую смесь для дальнейшего использования в птицеводстве, в том числе перепеловодстве.
Список литературы
Резюме. В данной работе представлены результаты изучения токсикологического и раздражающего действия на простейших и лабораторных животных новой пробиотической кормовой добавки Трилактосорб, представляющей собой смесь термофильных молочнокислых культур (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbruеckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus), выращенных на соевом растительном сырье с использованием сорбирующего горноминерального компонента. Изучение токсичности добавки на стилонихиях осуществлялось экспресс-методом путем воздействия на них различных фракций токсических веществ, извлеченных из исследуемой добавки водным и ацетоновым экстрактами. Результаты эксресс-оценки показали, что выживаемость сти-лонихий при действии на них экстрактов добавки Трилактосорба находилось в пределах, характеризующих её как малотоксичную добавку растительного происхождения. Осуществлялась изучение острой токсичности исследуемой добавки на мышах и крысах, а также её кожно-резорбтивного и раздражающего действия на слизистые оболочки глаз и ротовой полости. Однократное пероральное использование исследуемых доз пробиотической кормовой добавки Трилактосорб не вызывает гибели лабораторных животных, состояние лабораторных мышей и крыс оставалось удовлетворительным. Результаты накожных аппликаций показали, что в ходе эксперимента у лабораторных животных местного покраснения не отмечалось, отсутствовали повышение чувствительности, припухлость, воспаление, образование эритемы и отек кожи. Введение пробиотической кормовой добавки Трилактосорб в нижний отдел конъюнктивального мешка глаза вызывает незначительное покраснение слизистой оболочки и выделение слезных желез сразу после инсоляции, которые исчезали через несколько минут. Дальнейшие наблюдения за кроликами не выявили иной патологии. Изучение дополнительного раздражающего действия пробиотической кормовой добавки Трилактосорб на слизистую ротовой полости хомячков показало следующую клиническую картину: слизистая защечного мешка с обеих сторон во всех опытных группах хомячков была чистой, без покраснений, припухлостей, образование отеков и эритем зарегистрировано не было. По совокупности проведенных исследований индекс первичного раздражения изучаемой добавки равнялся нулю.
Ключевые слова: пробиотическая добавка, молочнокислые бактерии, сорбент, токсичность, стилонихии, мыши, крысы, кролики-альбиносы, поведение, аппетит, доза.
Сведения об авторах:
Мигина Елена Ивановна, аспирант кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики факультета перерабатывающих технологий ФГБОУ ВПО Кубанского госагроуниверситета; 350044, Россия, г. Краснодар, ул. Калинина 13, тел: 8(918) 255-10-07.
Лысенко Юрий Андреевич, кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики факультета перерабатывающих технологий ФГБОУ ВПО Кубанского госагроуниверситета; 350044, Россия, г. Краснодар, ул. Калинина 13, тел: 8(961)518-07-22.
Ответственный за переписку с редакцией: Кощаев Андрей Георгиевич, доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики факультета перерабатывающих технологий ФГБОУ ВПО Кубанского госагроуниверситета; 350044, Россия, г. Краснодар, ул. Калинина 13, тел: тел.: 8 (861) 221-57-84; e-mail: kagbio@mail.ru.
UDC 619:615.9]:636. 087.7
STUDY OF TOXICOLOGICAL AND IRRITANT EFFECT OF PROBIOTIC FEED ADDITIVE TRILACTOSORB FOR QUAIL
Koshchaev A. G., Migina E. I., Lysenko Y. A.
Summary. This article presents the results of the toxicological evaluation of new probiotic feed additive Trilactosorb on the express method stilonihiyas and by determining parameters of acute toxicity in mice and rats, as well as the study of its skin-resorptive and irritating actions to the mucous membranes of the eyes and mouth of laboratory animals. The studies revealed that probiotic supplement shows no toxic effects on survival stilonihyas under the action of its water and acetone extracts. In this case the viability of ciliates was 97,8 and 94,7 %, which is within the requirements for small toxicity of plant origin. According to study results of acute toxicity probiotic feed additive Trilactosorb failed to determine half-lethal dose. Condition experimental mice and rats remained satisfactory with well appetite, animals were mobile and the response to external stimuli remained the same as before use of additives. Disorder in the functional activity of the digestive and urinary systems, as well as a manifestation of other toxic effects was absent. Results of skin-resorptive and irritating to the eye conjunctiva, and further action on the oral mucosa showed that the primary irritation index probiotic feed additive Trilactosorb was zero. General condition of albino rabbits, hamsters and laboratory research at all stages remained satisfactory, toxicological changes in the irritating additives have been identified. General condition of albino rabbits, laboratory hamsters remained satisfactory at all stages of research, toxicological changes in the irritating additives have been identified.
Key words: probiotic supplements, lactobacilli, sorbent, toxicity, stilonihii, mouse, rat, albino rabbits, behavior, appetite, dose.
References
Author affiliation.
Migina Elena I., postgraduate student of the Department of Biotechnology, Biochemistry and Biophysics of the Kuban State Agrarian University; 13, Kalinina st., Krasnodar, 350044; ph.: 8(918)255-10-07.
Lysenko Yury A., Ph. D. in Biology, lecturer of the Department of Biotechnology, Biochemistry and Biophysics of the Kuban State Agrarian University; 13, Kalinina st., Krasnodar, 350044; ph.: 8(961)518-07-22.
Responsible for correspondence with the editorial board: Koshchayev Andrey G., D.Sc. in Biology, Professor, Vice Rector for Research of the Kuban State Agrarian University, Professor of Biotechnology, Biochemistry and Biophysics; 13, Kalinina st., Krasnodar, 350044. Ph. 8 (861) 221-57-84; email: kagbio@mail.ru.
http://vetkuban.com/num4_201405.html