Петенко А.И., Ширина А.А., Лысенко Ю.А.
ФГБОУ ВПО "Кубанский государственный аграрный университет", г. Краснодар
Якубенко Е.В. ГКУ КСББЖ "Краснодарская", г. Краснодар
Петенко И.А. ООО МИП "Кормовые концентраты", г. Краснодар
Выращивание здоровых, высокопродуктивных животных и птиц является одной из главной задач для достижения продовольственной биобезопасности Российской Федерации. Один из факторов, сдерживающих развитие отрасли животноводства и птицеводства, — желудочно-кишечные заболевания как заразной, так и незаразной этиологии. Основной путь в профилактике данных болезней — это повышение уровня естественной резистентности организма [4, 7].
На сегодняшний день многие факторы, влияющие на состав микроорганизмов мало изучены, однако достаточно хорошо известно, что количество и состав микрофлоры кишечника зависит от возраста, но в большей степени от условий содержания и кормления животных и птиц. Для коррекции микрофлоры и профилактики различных расстройств применяют бактерийные препараты — пробиотики. Их влияние затрагивает многие регуляторные системы, за счет чего активируется иммунитет, неспецифическая резистентность, адаптогенность, а в итоге сохранность и интенсивность роста организма [2, 10].
Используемые на ранних стадиях развития пробиотики способствуют заселению кишечника полезной симбионтной микрофлорой. Поэтому возможность создания благоприятного микробного фона в пищеварительном тракте с помощью пробиотиков и рационального кормления представляется важным моментом для повышения здоровья животных и птиц [3, 8].
Опыт использования пробиотиков, накопленный за последнее десятилетие, освещен недостаточно полно, практически нет научно - обоснованных рекомендаций для практического применения этих препаратов. Для подготовки такого рода рекомендаций следует проводить комплексные исследования. Необходимость их обоснована ещё тем, что в настоящее время увеличиваются поставки в Россию пробиотиков, причём предлагаются препараты, которые не находят применения в своих странах из-за недостаточной изученности, а также отсутствия данных о целесообразности и эффективности их применения [6, 9]. Разработка и внедрение новых отечественных пробиотиков, позволяющих добиться максимальной продуктивности в отрасли животноводства и птицеводства и повышающих естественную резистентность организма, является перспективным и актуальным направлением.
Материал и методика. Эксперименты проводили в виварии факультета ветеринарной медицины, на кафедре биотехнологии, биохимии и биофизики Кубанского государственного аграрного университета.
В опытах использовали новую кормовую пробиотическую добавку "Промомикс С", которая представляет собой смесь молочнокислых и пропионовокислых микроорганизмов на сухих иммобилизующих носителях, обладающих пребиотическими, сорбирующими и антитоксическими свойствами. Пробиотик является разработкой кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики КубГАУ и производится в содружестве с ОНО "Экспериментальная биофабрика" г. Углич.
Токсикологическая оценка пробиотической кормовой добавки "Промомикс С" изучалась путем определения параметров острой токсичности согласно ГОСТ Р ИСО 10993-11-2009. Кожно-резор-бтивное действие и раздражающее свойство на слизистые оболочки глаз изучали согласно ГОСТ Р ИСО 10993.10-99. В качестве дополнительного исследования раздражающего действия изучали влияние пробиотика "Промомикс С" на слизистую ротовой полости по ГОСТ Р ИСО 10993.10-99.
По результатам исследований было использовано 121 лабораторное животное (мыши, крысы, кролики, хомячки).
Экспериментальные животные находились в стандартных условиях вивария, имели свободный доступ к воде, нормальный температурный и световой режим, содержались в деревянных клетках с древесной стружкой в качестве подстилки и получали лабораторный гранулированный корм ПК 120-3. Перед началом лабораторных исследований животных выдерживали в течение 5 дней для акклиматизации.
Обсуждение результатов исследований. Оценку острой токсичности осуществляли на клинически здоровых беспородных белых мышах с начальной массой тела 18-20 г (возраст 2-2,5 мес.) и половозрелых беспородных белых крысах с массой тела 180-200 г (возраст 2,5-3 мес.) путем однократного приема пробиотика в смеси с кормом животными натощак, после 12-ти часовой голодной выдержки. В опыте были сформированы группы животных по принципу пар-аналогов обоего пола по 10 особей в каждой. Всего было исследовано 3 дозы пробиотика "Промомикс С". Отправным моментом для поиска доз служили известные данные аналогичных пробиотических кормовых добавок [1, 3, 5]. Обзор научной литературы показал, что при дозе пробиотиков 0,2% к массе корма проявляется максимальный профилактический эффект добавки. Таким образом, использовалась 3-х кратная, 5-ти кратная и 10-ти кратная доза пробиотика "Промо-микс С" от предполагаемой профилактической. В качестве групп контроля выступали: отрицательный контроль — мыши и крысы получали только стандартный лабораторный гранулированный корм ПК 120-3 и контроль модельной среды — лабораторные животные употребляли стандартный корм и наполнитель, который входит в состав пробиоти-ка "Промомикс С", в 10-и кратной дозе. Наблюдение проводили в течение двух недель с учетом изменения общего состояния и поведения подопытных лабораторных животных.
Результаты острой токсичности пробиотика "Промомикс С" на лабораторных животных приведены в таблице 1.
Таблица 1. Результаты острой токсичности пробиотика "Промомикс С" (n=10)
| Группа | Вид животного | Условия кормления | Результат испытаний, гол. | ||
|---|---|---|---|---|---|
| заболело | пало | выжило | |||
| Контроль отрицательный | мыши | ПК - полнорационный комбикорм | 0 | 0 | 10 |
| крысы | |||||
| Контроль модельной среды | мыши | ПК+2,0 % наполнителя | 0 | 0 | 10 |
| крысы | |||||
| 1-я опытная | мыши | ПК+0,6 % Промомикс С | 0 | 0 | 10 |
| крысы | |||||
| 2-я опытная | мыши | ПК+1,0 % Промомикс С | 0 | 0 | 10 |
| крысы | |||||
| 3-я опытная | мыши | ПК+2,0 % Промомикс С | 0 | 0 | 10 |
| крысы | |||||
В результате проведенных экспериментов в течение 14 дней было установлено, что однократное пероральное применение исследуемых доз пробиотика "Промомикс С" не вызывает токсических явлений и гибели у лабораторных животных за весь период наблюдения, не влияет отрицательно на их общее состояние и поведение. Состояние всех групп мышей и крыс оставалось удовлетворительным, с хорошо выраженным аппетитом, животные были подвижны, реакция на внешние раздражители оставалась прежней. Нарушений функциональной активности органов пищеварительной и мочевыделительной систем не выявлено.
Таким образом, на основании проведенных опытов определить полулетальную дозу (ЛД50) не удалось, следовательно, учитывая, то что использование пробиотика "Промомикс С" переносится лабораторными животными без видимых последствий в максимальных дозах его можно классифицировать как малотоксичный препарат.
В результате того, что пероральное использование пробио-тической кормовой добавки "Промомикс С" предполагает возможное его попадание на кожу и слизистые оболочки глаз, изучалось кожно-резорбтивное действие.
Изучение кожно-резорбтивного действия пробиотика проводили на 3-х половозрелых кроликах-альбиносах обоего пола массой 2,0-2,5 кг, которым за сутки до проведения эксперимента тщательно выстригали шерсть на симметричных участках обоих боков для аппликации, одна из которых служила контролем. Площадь обрабатываемой поверхности кожи составляла 5-8 % поверхности тела животного. 0,5 г пробиотика смачивали небольшим объемом воды и наносили на участок кожи, а сверху накладывали марлевый тампон, и фиксировали его полупрозрачной повязкой с 4-х часовой экспозицией. Местное действие пробиотика на кожу оценивалась сразу после окончания экспозиции, а также через 24, 48 и 72 часа. При этом, учитывали степень кожной реакции (покраснение, повышение чувствительности, припухлость, воспаление), включая эритему и отек, а также возможность появления общей реакции лабораторных животных.
Раздражающее действие пробиотика "Промомикс С" методом накожных аппликаций показало, что в ходе исследования не отмечалось у подопытных животных местного покраснения, повышения чувствительности, припухлости, воспаления, образования эритемы и отека кожи, в результате чего, индекс первичного раздражения равен нулю.
Изучение раздражающего действия на слизистые оболочки глаз пробиотика "Промомикс С" проведено на 3-х половозрелых кроликах-альбиносах обоего пола массой 2-3 кг. Перед началом эксперимента обращали внимание на состояние глаз каждого кролика для выявления выраженных повреждений. Каждому животному аккуратно в нижний отдел конъюнктивального мешка правого глаза вводили такое количество добавки, которое занимает объем 0,1 см3. После инсоляции веки соединяли и держали в таком положении в течение 1-2 сек. Левый глаз служил контролем. Обследование глаза животных проводили через 1, 24, 48 и 72 часа после внесения пробиотика. При этом, учитывали состояние роговицы, радужной оболочки, конъюнктивы, хематоз (отек конъюнктивы) и наличие выделений.
В ходе исследования раздражающего действия на слизистую глаза были получены следующие результаты: инсоляция добавки в нижний отдел конъюнктивального мешка вызывает небольшое покраснение конъюнктивы и выделение слезных желез сразу после введения, которые исчезали через несколько минут. В продолжение дальнейшего наблюдения за лабораторными животными нами не отмечалось помутнения роговицы глаза, радужная оболочка была без видимых изменений, также не отмечали хематоз (отек конъюнктивы) и выделений из глаз.
Следует отметить, что общее состояние кроликов-альбиносов в экспериментах оставалось без изменений.
Для раздражающего действия на слизистую ротовой полости использовали здоровых половозрелых хомячков обоего пола. Было сформировано три группы животных по 5 голов, получавших разную дозу добавки. Пробиотик "Промомикс С" в дозе 0,6, 1,0 и 2,0 г разводили в 10 мл физического раствора, затем ими пропитывали ватные шарики. Пропитанные шарики помещали непосредственно в один защечный мешок каждого животного, а другой мешок служил контролем. Продолжительность контакта слизистой рта с материалом состав-ля-ла пять минут. На каждого хомячка надевали воротник, располагающийся вокруг шеи так, чтобы не мешать нормальному питанию и дыханию, но при этом препятствовать выталкиванию шарика изо рта. По итогу эксперимента учитывали макроскопическое исследование защечных мешков непосредственно после извлечения шариков и оценивали состояние слизистой, определяя степень раздражающей реакции.
При проведении дополнительного исследования раздражающего действия пробиотика "Промомикс С" на слизистую ротовой полости, после аппликации пропитанных шариков разными дозами добавки, были получены следующие результаты: слизистая защечного мешка как контрольной стороны, так и опытной во всех группах хомячков, была чистой, без покраснений, припухлостей, образование отеков и эритем зарегистрировано не было. Таким образом, индекс раздражающего действия равнялся нулю, что говорит об отсутствии раздражающего действия на слизистую ротовой полости используемой пробиотической кормовой добавки "Промомикс С".
Выводы. В результате проведенных экспериментов по изучению токсикологических свойств пробиотической кормовой добавки "Промомикс С" установлено, что по показателям острой токсичности он относится к малотоксичным препаратам, так как полулетальной дозы установить не удалось. Данные кожно-резорбтивного действия и влияния на слизистую глаз, а также ротовой полости показали, что пробиотик не обладает раздражающим свойством.
Список литературы
Резюме.
В данной работе представлены результаты токсикологической оценки новой пробиотической добавки "Промомикс С" по параметрам острой токсичности, кожно-резорбтивного и раздражающее действия на слизистые оболочки глаз и ротовой полости.
Оценку острой токсичности осуществляли на клинически здоровых беспородных белых мышах путем однократного приема пробиотика в смеси с кормом натощак после 12-ти часовой голодной выдержки. Установлено, что однократное пероральное применение пробиотика "Промомикс С" не вызывает токсических явлений и гибели у лабораторных животных за весь период наблюдения, не влияя на общее состояние и поведение.
Изучение кожно-резорбтивного действия пробиотика проводили на 3-х половозрелых кроликах-альбиносах. Раздражающее действие пробиотика "Промомикс С" методом накожных аппликаций показало, что в ходе исследования не отмечалось у подопытных животных местного покраснения, повышения чувствительности, припухлости, воспаления, образования эритемы и отека кожи, в результате чего индекс первичного раздражения равен нулю.
Для раздражающего действия на слизистую ротовой полости использовали здоровых половозрелых хомячков. Пропитанные шарики помещали непосредственно в один защечный мешок каждого животного, а другой мешок служил контролем. Авторами доказано, что индекс раздражающего действия равнялся нулю, что говорит об отсутствии раздражающего действия на слизистую ротовой полости используемой пробиотической кормовой добавки "Промомикс С".
По результатам проведенных экспериментов было установлено, что используемый в опытах пробиотик не обладает выраженным токсическим и раздражающим действием, в результате чего он регистрируется как малотоксичный препарат.
Ключевые слова: пробиотик, кормовая добавка, лабораторные животные, мышь, крыса, кролик, хомяк, поведение, токсичность, аппликация, аппетит, доза.
Сведения об авторах:
Петенко Александр Иванович, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заведующий кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики ФГБОУ ВПО "Кубанский государственный аграрный университет"; 350044, Россия, г. Краснодар, ул. Калинина, 13, тел.: 8(918)439-59-85.
Ширина Анна Александровна, аспирант кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики ФГБОУ ВПО "Кубанский государственный аграрный университет"; 350044, Россия, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.
Якубенко Елена Васильевна, кандидат биологических наук, начальник ГКУ КСББЖ "Краснодарская"; 350004, г. Краснодар, ул. Калинина, 15/1; тел.: (861) 221-63-77.
Петенко Иван Александрович, директор ООО МИП "КоКон"; 350916, Краснодарский край, г. Краснодар, ст. Елизаветинская, ул. Широкая, 231.
Ответственный за переписку с редакцией: Лысенко Юрий Андреевич, ассистент кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики ФГБОУ ВПО "Кубанский государственный аграрный университет"; 350044, Россия, г. Краснодар, ул. Калинина, 13, тел.: 8(961)518-07-22; e-mail: yuraduban45@ mail.ru.
UDC 619:615.9]:636. 087.7
EVALUATION OF ACUTE TOXICITY AND IRRITATION OF PROBIOTIC FEED
ADDITIVE "PROMOMIX C" Petenko A.I., Shirina A.A., Lysenko Yu.A., Yakubenko E.V., Petenko I.A.
Summary. For toxicological evaluation of new probiotic additive "Promomix C", which is a mixture of lactic acid and propionic acid microorganisms on dry immobilizing carriers have prebiotic, antitoxic and sorption properties on the acute oral toxicity, skin-resorptive and irritating effect on the mucous membranes of the eyes and mouth cavity authors conducted experiments on mice, rats, rabbits, and hamsters.
Evaluation of acute toxicity was carried out on clinically healthy mongrel white mice by a single dose of probiotics in the feed mixture on an empty stomach after a 12-hour famine exposure. It has been found that single oral probiotic use does not cause toxic effects and loss in laboratory animals. Laboratory animals were mobile, response to external stimuli remained the same. Violations of the functional activity of the digestive and urinary systems have been identified.
Study of skin-resorptive action was carried on mature albino rabbits by skin application. In the course of studies no local redness, sensitivity, swelling, inflammation, skin erythema and edema was noted. Authors noted no clouding of the cornea and no chemosis (conjunctival edema), iris had no visible changes.
Healthy mature hamsters were used for studies of the irritant effect on the oral mucosa. Soaked beads were placed directly into one cheek pouch of each animal while the other served as a control. Contact with the oral mucosa material was five minutes. Redness, swelling, erythema and edema formation was not registered.
As a result of experiments on the toxicological properties of the probiotic feed additive "Promomix C" is was established that in terms of acute toxicity it relates to low-toxic preparations due to the fact that half-lethal dose has not been determined.
Key words: probiotics, feed additive, laboratory animals, mouse, rat, rabbit, hamster, behavior, toxicity, application, appetite, dose.
References:
Author affiliation:
Petenko Aleksander I., D.Sc. in Agriculture, Professor, Head of the department of biotechnology, biochemistry and biophysics of the Kuban State Agrarian University; 13, Kalinina st., Krasnodar, 350044; phone: 8(918)441-64-72.
Shirina Anna A., postgraduate student of the department of biotechnology, biochemistry and biophysics of the Kuban State Agrarian University; 13, Kalinina st., Krasnodar, 350044.
Yakubenko Elena V., Ph. D. in Biology, head of the Krasnodar Regional Station of fighting against animal diseases; 15/1, Kalinina st., Krasnodar, 350044; ph.: 8 (918) 45-42-355; e-mail: vetkuban@mail.ru.
Petenko Ivan A., director of ООО MIP "to)Kon"; 231, Shirokaya st., Krasnodar, 350916.
Responsible for correspondence with the editorial board: Lysenko Yury A., assistent of the department of biotechnology, biochemistry and biophysics of the Kuban State Agrarian University; 13, Kalinina st., Krasnodar, 350044; phone: 8(961)518-07-22; e-mail: yuraduban45@mail.ru.
http://vetkuban.com/num4_20136.html