УДК 619:636.2:616.9/578.825.1:616-003.263
DOI 10.33861/2071-8020-2024-3-6-8
Симанова И. Н. Вологодский филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения
«Федеральный научный центр -Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной
ветеринарии имени К. И. Скрябина и Я. Р. Коваленко Российской академии наук», г. Вологда
Герпесвирус крупного рогатого скота типа 5 (далее, BOHV-5), известный также как бычий энцефалит, относится к роду Varicellovirus, подсемейство Alphaherpesvirinae, семейство Herpesviridae, порядка Герпесвирусы. Геном герпесвируса содержит двухцепочечную ДНК (~138 000 пар нуклеотидов), кодирующую около 70 белков, которые на 82% сходны с белками герпесвируса - возбудителя ИРТ [1, 2].
Инфицирование молодняка BOHV-5 вызывает фатальный менингоэнцефалит. Инфекция у крупного рогатого скота, в основном, проходит в латентной форме. Исследования последних лет показывают, что вирус также принимает активное участие в репродуктивной патологии крупного рогатого скота. По данным Шу-ляк А.Ф., в результате латентной инфекции в организме животного происходит репликация полноценных вирионов с появлением их в определенных органах и тканях, в частности, в сперме [3]. По данным Шарифзаде Али и др. (2015), вирус попадает в сперму во время эякуляции из слизистых оболочек органов репродуктивного тракта. В связи с этим имеется определенный риск распространения герпесвирусной инфекции через сперму. Данные об обнаружении герпесвирусов крупного рогатого скота в сперме быков в России и их роли в инфекционной патологии весьма ограничены.
Цель исследований: идентификация ДНК BoHV-5 в консервированной сперме быков-производителей методом ПЦР.
Материалы и методы. В ходе работы было исследовано 20 образцов семенной жидкости от быков-доноров. Пробы до исследования находились в пайетах в сосуде Дьюара при температуре -196°C. В лабораторию вирусологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН г. Москва пайеты были доставлены в термосе со льдом. Перед началом исследования сперма в стерильных условиях была помещена в пробирки типа Эппендорф.
ДНК из образцов выделяли с помощью набора реагентов «ДНК-экстран» («Синтол», Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Праймеры и режимы амплификации были подобраны согласно ранее опубликованной работе [4]. Анализ фрагментов ПЦР был проведен методом электрофореза в 1,5 агарозном геле, содержащем бромистый этидий.
Для учета результата использован трансиллюминатор с ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм. Размер фрагмента генома BoHV составлял 400 п.н. Определение нуклеотидных последовательностей осуществлялось на автоматическом секвенаторе ABI Prism Genetic Analyzer 3100 («AppliedBiosystems», США). При построении филогенетической дендрограммы нуклеотидные последовательности, представленные в базе данных NCBI GenBank, были выровнены с помощью программы Clustal W. Для построения деревьев использована программа Mega 7.0.
Результаты исследований и их обсуждение. В настоящее время при разведении крупного рогатого скота широко используются технологии искусственного осеменения коров спермой, полученной от быков-доноров из различных племенных центров. Современные технологии получения спермодоз предполагают использование глубокого замораживания и применения криопротекторов, что позволяет некоторым возбудителям сохранять жизнеспособность и делает использование антибиотиков недостаточно эффективным. Широкая продажа спермодоз племенных быков увеличивает потенциальные риски распространения инфекционных болезней [5].
В отношении оценки качества и безопасности спермы быков в России действует ГОСТ 26030, согласно которому определение патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов в спермо-дозах производится микробиологическим методом по ГОСТ ISO 8607 и ГОСТ 32198. Однако, необходимо выявлять и быков-вирусоносителей. Только постоянное тестирование всей полученной спермы позволяет гарантировать ее чистоту, поэтому для диагностики используют молекулярные методы, особенно ПЦР.
К числу распространенных вирусов крупного рогатого скота относятся альфагерпесвирусы, которые имеют широкий круг естественных хозяев, включающих буйволов, овец, коз и благородных северных оленей [6]. По данным литературы, в ряде стран, BoHV был обнаружен в сперме быков- производителей [6, 7, 8, 9].
В 2015-2021 гг. в животноводческих хозяйствах Вологодской области наблюдали массовые заболевания телят с симптомами угнетения, лихорадки, конъюнктивита, ринита. У коров и телок диагностировали вульвовагиниты. При исследовании проб носовых истечений, фекалии телят, а также влагалищной слизи у коров, был обнаружен герпесвирус 5-го типа [4, 10]. Полученные ранее результаты послужили основанием для исследования спермы как возможного источника инфекции на наличие вируса.
Результаты ПЦР показали, что в образцах присутствует BoHV. При электрофоретическом анализе продуктов амплификации был идентифицирован фрагмент ДНК длиной 400 п.н. в виде ярковы-раженных полос ампликонов мишени (рисунок 1).
Рис. 1. Анализ фрагментов генома (М - маркер; 1, 2, 3, 4 - номера образцов семенной жидкости)
Для уточнения полученных результатов проведено определение нуклеотидных последовательностей продуктов амплификации (рисунок 2).
Рис. 2. Дендрограмма, отражающая степень филогенетического родства исследуемых изолятов и референтных штаммов базы данных INSD, основанная на анализе нуклеотидных последовательностей участка гена, кодирующего гликопротеин B (gpB) альфагерпесвирусов крупного рогатого скота
Филогенетический анализ показал, что фрагменты генома новых изолятов близки к ранее известным последовательностям (AY 745876, P 160/96, ISO 97/45), представленным в базе данных GenBank, и составляют с ними одну генетическую группу.
На рисунке 2 представлена дендрограмма, отражающая степень филогенетического родства исследуемых изолятов и референтных штаммов базы данных INSD, основанная на анализе нуклеотидных последовательностей участка гена, кодирующего гликопротеин B (gpB) альфагерпесвирусов крупного рогатого скота.
Филогенетический анализ показал, что фрагменты генома новых изолятов близки к ранее известным последовательностям (AY 745876, P 160/96, ISO 97/45), представленным в базе данных GenBank, и составляют с ними одну генетическую группу. Так, оба изолята (a7 и a9), выделенные из семенной жидкости быков-производителей, имеют сходство в 99% со штаммом ISO 97/45 аль-фагерпесвируса крупного рогатого скота типа 5, выделенным в Бразилии из головного мозга крупного рогатого скота в 1997 году.
Таким образом, в сперме быков-производителей обнаружен альфагерпесвирус крупного рогатого скота типа 5.
Заключение. Проведенные исследования показали, что инфицированная сперма быков-производителей может являться одним из основных источников распространения герпесвируса крупного рогатого скота типа 5 среди молочного поголовья в хозяйствах Вологодской области. Поэтому необходимо целенаправленное исследование семенной жидкости на наличие герпесвирусной инфекции крупного рогатого скота типа 5, а также тщательный контроль спермопродукции в течение всего периода эксплуатации быков с интервалом шесть месяцев [11].
Список литературы:
1. Мищенко, А. В. Экологические особенности герпесвируса крупного рогатого скота типа 5 / А. В. Мищенко, В. А. Мищенко, В. В. Думова // Ветеринария Кубани. 2015. № 2. С. 19-21.
2. Мищенко, В. А. Особенности массовых ассоциированных респираторных заболеваний взрослого крупного рогатого скота / В. А. Мищенко, В. В. Думова, О. Ю. Черных // Ветеринария Кубани. № 3. С. 13-15.
3. Выявление ДНК вируса ИРТ КРС с помощью полимеразной цепной реакции / А. Г. Глотов, С. В. Котенев, Т. И. Глотова [и др.] // Ветеринария. 2003. № 5. С. 21.
4. Simanova I. N. et al. Molecular-genetic analysis of bovine herpesvirus-5 (BOHV-5) in the cows in farms of Vologda Region // IOP Conference Series Earth and Environmental Science. 2020. P. 72042.
5. Шуляк, А. Ф. Характеристика изолятов BHV-1, выделенных от племенных быков / А. Ф. Шуляк, Г. Н. Величко // Молекулярная диагностика. 2017. № 2. С. 380.
6. Simanova I. N. et al. Identification of bovine herpesvirus type 5 in nasal swabs of natinfected calves by polymerase chain reaction // IOP Conference Series Earth and Environmental Science. 2021. P. 42062.
7. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution. 1987. No. 4. P. 406-425.
8. Moran P. E. et al. Search for the genome of bovine herpesvirus type 1, 4 and 5 in bovine semen // Open Veterinary Journal. 2013. No. 3. P. 126-130.
9. Isakov M.M., Solodiankin O.S., Bolotin V.I., Gerilovyich A.P. PCR detection of genital infections in bull semen different regions of Ukraine 2013-2016 // Arhiv veterinarske medicine. - 2016. - № 2. - P. 63-70.
10. Котенева, С. В. Выявление вируса инфекционного ринотрахеи-та крупного рогатого скота при патологии органов воспроизводства / С. В. Котенева, Т. И. Глотова, А. Г. Глотов // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. 2015. № 8. С. 443-445.
11. Мониторинг инфицированности спермы быков-производителей вирусами на головном предприятии / А. В. Нефедченко, С. В. Котенева, Т. И. Глотова, А. Г. Глотов // Ветеринария. 2022. № 9. С. 18-23.
Резюме. К числу распространенных вирусов крупного рогатого скота относят альфагерпесвирусы, имеющие широкий круг естественных хозяев. В течение нескольких лет в животноводческих предприятиях Вологодской области наблюдались массовые заболевания телят с симптомами респираторной патологии (насморк, кашель, лихорадка). У коров и телок диагностировались вульвоваги-ниты. При исследовании образцов носовых истечений, фекалий, а также молока, был обнаружен герпесвирус крупного рогатого скота типа 5. Полученные ранее результаты послужили основанием для исследования спермы быков как возможного источника инфицирования на наличие вышеуказанного вируса. Экспериментальные исследования проводились в нескольких животноводческих хозяйствах Вологодской области, лабораторные исследования - в лаборатории вирусологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН (г. Москва). При исследовании спермы методом полимеразной цепной реакции были обнаружены фрагменты генома герпесвируса крупного рогатого скота. В результате секвенирования определено, что данный возбудитель относится к типу 5. Полученные ампликоны были изучены методом филогенетического анализа, который показал, что фрагменты генома новых изолятов близки к ранее известным последовательностям (AY 745876, P 160/96, ISO 97/45), представленным в базе данных GenBank, и составляют с ними одну генетическую группу. Проведенные исследования показали, что инфицированная сперма быков-производителей является одним из основных источников распространения герпесвируса крупного рогатого скота типа 5 среди молочного поголовья в хозяйствах Вологодской области. Таким образом, необходимо целенаправленное исследование семенной жидкости на наличие герпесвирусной инфекции крупного рогатого скота типа 5, а также тщательный контроль спермопродукции в течение всего периода эксплуатации быков с интервалом 6 месяцев.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, быки, сперма быков, ДНК, альфагерпесвирус, инфекционные болезни, исследования, полимеразная цепная реакция, электорофорез, секвенирование, геном.
Сведения об авторе: Симанова Ирина Николаевна, соискатель, заведующий отделом по изучению болезней животных инфекционной этиологии - Вологодский филиал ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН; 160009, г. Вологда, ул. Чехова, 10; тел.: 8-921-8273359; e-mail: irina_simanowa@mail.ru - ответственный за переписку с редакцией.
http://vetkuban.com/num3_202402.html