УДК 619:615.065:615.375:636.028
DOI 10.33861/2071-8020-2021-3-7-10
Грицюк В.А., Востроилова Г.А., Хохлова Н.А., Чаплыгина Ю.А. Федеральное государственное бюджетное
научное учреждение «Всероссийский научноисследовательский ветеринарный институт
патологии, фармакологии и терапии», г. Воронеж
Воспаление молочной железы коров, возникающее на фоне негативных факторов внешней среды, в настоящее время остается актуальной проблемой и является причиной значительных экономических потерь на животноводческих комплексах. Вероятность возникновения мастита в сухостойный период в 20 раз выше, чем в лактационный, при этом наиболее часто воспаление молочной железы регистрируется сразу после отёла. Ряд исследований показали, что заболеваемость коров в стаде составляет от 10 до 80%. Воспаление молочной железы у коров также может протекать в скрытой (субклинической) форме, которая встречается в 3-7 раз чаще, чем клинический мастит, и сохраняется в течение 1-2 лактаций. За счёт мастита происходит снижение не только молочной продуктивности и репродуктивной функции коров, но и изменение состава и качественных характеристик молока, что зачастую ведет к заболеваниям новорожденных телят [1, 5, 10, 14].
Наиболее часто применяемыми средствами для лечения и профилактики маститов являются антимикробные препараты. Однако их терапевтическая эффективность может быть недостаточна вследствие развития устойчивости возбудителей и распространения штаммов патогенных бактерий с высокой степенью антибиотикоре-зистентности. Так же нерациональное использование антибиотиков привело к появлению устойчивости не только у болезнетворной, но и условно-патогенной микрофлоры, что создает дополнительную проблему и опасность развития патологии [2, 3, 4, 6].
На сегодняшний момент одним из вариантов противомаститной терапии без применения антибиотиков является использование иммуностимулирующих препаратов на основе рекомбинантных интерферонов, обладающих широким спектром действия за счёт активации иммунной системы. Бактериостатический эффект обусловлен значительным нарушением биоэнергетических процессов у микроорганизмов из-за истощения триптофана, а опосредованный бактерицидный эффект обусловлен образованием оксида азота и активных форм кислорода в макрофагах [13, 15, 16, 17].
Одним из новых препаратов является Субмастин-КРС, в 1 мл которого содержится смесь видоспецифических для крупного рогатого скота рекомбинантных цитокинов суммарной активностью не менее 104МЕ/мл и 75000 МЕ/мл витамина А.
Перед внедрением в ветеринарную практику любой препарат должен пройти ряд обязательных доклинических исследований, в том числе определение подострой токсичности. Многократное повторное введение препарата осуществляют с целью выявления токсических эффектов, органов-мишеней и обратимости вызываемых повреждений [11, 12].
Целью нашего исследования было определение параметров токсичности препарата Субмастин-КРС в подостром опыте.
Материалы и методы исследований. В качестве тест-систем использовали разнополых здоровых половозрелых белых беспородных крыс разведения вивария ФГБНУ «ВНИВИПФиТ». Содержание животных и манипуляции с ними соответствовали European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123, Strasbourg, 1986) и Директиве 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях. Лабораторные крысы содержались в условиях вивария в соответствии с требованиями ГОСТ 33215-2014 и ГОСТ 33216-2014 [8, 9].
В соответствии с дизайном эксперимента, одобренного Комиссией по биоэтике ФГБНУ «ВНИВИПФиТ», изучение подострой токсичности проводили на 24 белых крысах-самцах с массой тела 165-185 г и на 24 белых крысах-самках с массой тела 150-170 г при внутримышечном введении исследуемого препарата в течение 30 дней согласно «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [7]. Препараты вводили ежедневно один раз в день в дозах 0,1 мл/кг (терапевтическая) и 1,0 мл/кг (в 10 раз превышающая терапевтическую).
Общетоксическое действие препарата оценивали ежедневно в течение всего опыта посредством клинического наблюдения (внешний вид, поведение, поедаемость корма и приём воды, ритм и частоту сердцебиения, количество дыхательных движений и глубину дыхания); по динамике массы тела животных при взвешивании 1 раз в 7 дней; морфологическим и биохимическим показателям крови - по окончании курса применения препарата Субмастин-КРС.
Оценивали вегетативный статус крыс по состоянию шерстного покрова, слизистых, ширины глазных щелей, наличию саливации, диареи, опрятности животных.
Морфологические характеристики периферической крови определяли по стандартной методике подсчета клеток в камере Горяева.
Биохимические показатели определяли в сыворотке крови: концентрацию общего белка, общих липидов, мочевины, глюкозы, креатинина, холестерина, билирубина, активность ферментов аспартат- и аланинаминотрасфераз (АсАТ и АлАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) -наборами фирмы «Витал» (Санкт-Петербург); фракции белка - электрофорезом в агарозном геле.
Для исследования внутренних органов часть грызунов из каждой группы подвергали эвтаназии передозировкой углекислого газа в специальной камере через 30 дней от начала опыта.
В опыте использовали контрольную группу крыс (той же численности и состава, что и опытные), которым применяли стерильный изотонический раствор хлорида натрия. Ввиду того, что животные, находясь в длительном опыте, могут подвергаться действию ряда побочных факторов, контрольная группа содержалась в аналогичных условиях.
Результаты исследований и их обсуждение. При изучении подострой токсичности в опытных и контрольной группах на протяжении всего опыта гибели белых крыс не регистрировали. Все животные отличались активным поведением. Внешних признаков токсикоза не наблюдалось. Фекалии оформленные, темно-серого цвета. Корм и воду принимали охотно. Координация движений, состояние кожно-волосяного покрова, окраска слизистых оболочек у животных опытных и контрольной групп не имели различий и соответствовали видовым физиологическим нормам. Многократное введение Суб-мастина-КРС не вызывало изменений в двигательной активности подопытных животных, реакции на внешние раздражители, отклонений в поведенческих реакциях.
Лабораторные крысы на протяжении эксперимента потребляли обычное количество корма и воды. Масса тела животных увеличивалась во всех группах, при этом изменения по массе тела животных опытных и контрольной групп не имели достоверных различий (табл. 1).
Таблица 1 Влияние многократного введения Субмастина-КРС на динамику массы тела у крыс
| Дозы, мл/кг | Количество животных | Через, дней | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Исходная | 10 | 20 | 30 | ||
| Самцы | |||||
| Контроль | 8 | 175,6±5,4 | 183,4±4,1 | 194,6±6,3 | 213,8±5,4 |
| 0,1 | 8 | 171,9±4,8 | 180,1±5,2 | 190,5±4,7 | 210,9±5,3 |
| 1,0 | 8 | 174,7±4,3 | 182,4±3,9 | 193,2±7,1 | 213,3±10,4 |
| Самки | |||||
| Контроль | 8 | 166,7±5,9 | 176,4±5,9 | 196,4±8,3 | 235,1±9,7 |
| 0,1 | 8 | 164,8±4,2 | 175,3±8,1 | 198,0±7,6 | 230,7±6,8 |
| 1,0 | 8 | 161,9±4,8 | 170,8±7,7 | 195,7±9,3 | 234,1±11,7 |
Таким образом, в испытанных дозах при внутримышечном введении животным Субмастина-КРС общетоксических эффектов у крыс не обнаружено.
Данные измерения ректальной температуры крыс проводили с помощью электрического медицинского термометра ТПЭМ-1 (допустимая основная погрешность от диапазона измеряемых температур ±1%) (табл. 2).
Таблица 2 Влияние препарата Субмастин-КРС на температуру тела белых крыс (С0)
| Сроки исследования, сут. | Доза, мл/кг | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Контроль | 0,1 | 1,0 | ||||
| ♀ | ♂ | ♀ | ♂ | ♀ | ♂ | |
| Фон | 36,6±0,3 | 36,2±0,4 | 35,9±0,6 | 35,6±0,7 | 35,6±0,7 | 36,1±0,3 |
| 15 | 35,7±0,5 | 36,4±0,8 | 36,0±0,4 | 36,2±0,3 | 36,2±0,6 | 36,4±0,4 |
| 30 | 36,1±0,5 | 35,9±0,6 | 36,3±0,6 | 36,0±0,6 | 35,8±0,3 | 35,6±0,7 |
Данные измерения ректальной температуры свидетельствуют об отсутствии различий между таковой у животных опытных и контрольной групп, при этом, можно с уверенностью говорить об апирогеннос-ти лекарственной формы препарата Субмастин-КРС.
Для характеристики возможного токсического влияния препарата на паренхиматозные органы у крыс, многократно получавших препарат, были исследованы весовые коэффициенты внутренних органов и биохимические показатели крови, отражающие состояние основных метаболических процессов в организме.
Анализ данных некропсии крыс всех исследованных групп показал, что при макроскопическом исследовании изучаемых органов различий между группами не установлено.
Результаты исследований, представленные в таблице 3, свидетельствуют, что 30-дневное применение препарата в испытанных дозах у крыс не вызывает изменений относительной массы внутренних органов - тимуса, селезенки, печени, почек, надпочечников, сердца, легких, семенников по сравнению с таковыми у животных.
Таблица 3 Весовые коэффициенты внутренних органов крыс после 30-дневного внутримышечного введения Субмастина-КРС
| Органы | Группа животных | ||
|---|---|---|---|
| Контроль | 0,1 | 1,0 | |
| Самцы крыс (п=8 в каждой группе) | |||
| Тимус | 0,72±0,05 | 0,71±0,05 | 0,78±0,16 |
| Селезенка | 4,44±0,31 | 3,87±0,28 | 3,77±0,09 |
| Печень | 29,8±2,15 | 29,3±0,27 | 30,9±0,36 |
| Почки | 5,40±0,26 | 5,75±0,10 | 5,69±0,25 |
| Надпочечники | 0,20±0,014 | 0,20±0,019 | 0,21±0,029 |
| Сердце | 3,19±0,07 | 3,29±0,08 | 3,44±0,13 |
| Легкие | 5,56±0,18 | 5,23±0,03 | 5,49±0,03 |
| Семенники | 12,9±0,24 | 12,4±0,71 | 12,1±0,10 |
| Самки крыс (п=8 в каждой группе) | |||
| Тимус | 1,01±0,04 | 1,22±0,13 | 1,05±0,08 |
| Селезенка | 4,00±0,33 | 3,96±0,10 | 3,83±0,14 |
| Печень | 30,1±1,51 | 31,1±1,64 | 29,9±1,07 |
| Почки | 5,62±0,16 | 5,48±0,13 | 5,55±0,21 |
| Надпочечники | 0,21±0,019 | 0,20±0,004 | 0,20±0,015 |
| Сердце | 3,55±0,15 | 3,48±0,18 | 3,78±0,13 |
| Легкие | 5,28±0,15 | 5,32±0,32 | 5,11±0,28 |
Препарат в изученных дозах не оказывал влияние на морфологические показатели крови животных. Об этом свидетельствует отсутствие межгрупповых различий в содержании гемоглобина, количества эритроцитов, лейкоцитов у крыс (табл. 4).
Таблица 4 Морфологические показатели крови крыс при определении подострой токсичности препарата Субмастин-КРС
| Группа | Показатели | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Эритроциты, 1012/л | Тромбоциты, 109/л | Гемоглобин, г/л | Гематокрит, % | Лейкоциты, 109/л | |
| Крысы-самцы | |||||
| Контроль | 8,87±0,34 | 272,4±8,1 | 126,6±3,2 | 39,9±1,3 | 8,12±0,40 |
| 0,1 | 8,77±0,29 | 269,2±7,6 | 130,2±3,2 | 37,4±1,3 | 8,27±0,29 |
| 1,0 | 8,05±0,15 | 277,6±8,2 | 130,7±3,4 | 38,8±1,7 | 7,90±0,44 |
| Крысы-самки | |||||
| Контроль | 8,62±0,56 | 269,7±9,2 | 129,9±4,1 | 40,1±2,0 | 7,85±0,51 |
| 0,1 | 8,70±0,45 | 270,0±10,1 | 130,7±3,5 | 39,8±1,8 | 7,96±0,70 |
| 1,0 | 8,34±0,25 | 268,5±7,6 | 131,1±6,2 | 39,9±1,7 | 8,02±0,45 |
При исследовании крови животных (табл. 5), которым применяли Субмастин-КРС, не отмечено достоверных изменений основных биохимических показателей крови по сравнению с контролем.
Таблица 5 Влияние хронического введения Субмастина-КРС на биохимические показатели крови крыс
| Показатели | Контроль | Группа животных | |
|---|---|---|---|
| 0,1 мл/кг | 1,0 мл/кг | ||
| Крысы-самцы | |||
| АЛТ, мМ/л.час | 0,75±0,09 | 0,77±0,10 | 0,71±0,08 |
| АСТ, мМ/л.час | 1,25±0,12 | 1,23±0,09 | 1,03±0,04 |
| ЩФ, мМ/л.час | 5,00±0,15 | 4,67±0,10 | 4,62±0,14 |
| Глюкоза, мМ/л | 7,74±0,51 | 7,62±0,23 | 7,80±0,17 |
| Общ. белок, г/л | 66,0±2,56 | 68,9±1,98 | 67,2±2,13 |
| Триглицериды, мМ/л | 0,76±0,01 | 0,73±0,02 | 0,76±0,02 |
| Общ.липиды, г/л | 2,10±0,10 | 2,04±0,11 | 1,89±0,06 |
| Холестерин, мМ/л | 1,42±0,20 | 1,36±0,10 | 1,44±0,14 |
| Креатинин, мкМ/л | 47,3±2,5 | 48,2±2,9 | 46,7±1,5 |
| Мочевина, мМ/л | 3,95±0,60 | 3,28±0,25 | 3,62±0,16 |
| Билирубин, мкМ/л | 3,25±0,24 | 3,25±0,11 | 3,30±0,20 |
| Крысы-самки | |||
| АЛТ, мМ/л.час | 0,65±0,05 | 0,68±0,11 | 0,60±0,04 |
| АСТ, мМ/л.час | 1,31±0,19 | 1,34±0,09 | 1,21±0,07 |
| ЩФ, мМ/л.час | 5,32±0,27 | 5,12±0,19 | 5,52±0,21 |
| Глюкоза, мМ/л | 7,13±0,43 | 7,00±0,34 | 7,18±0,29 |
| Общ.белок, г/л | 70,1±3,24 | 71,5±2,11 | 70,3±4,68 |
| Триглицериды, мМ/л | 0,70±0,01 | 0,75±0,03 | 0,70±0,06 |
| Общ.липиды, г/л | 1,78±0,09 | 1,84±0,15 | 1,68±0,03 |
| Холестерин, мМ/л | 1,36±0,14 | 1,25±0,09 | 1,20±0,11 |
| Креатинин, мкМ/л | 40,4±4,1 | 46,9±3,1 | 41,5±4,5 |
| Мочевина, мМ/л | 4,16±0,51 | 4,21±0,16 | 4,00±0,22 |
| Билирубин, мкМ/л | 2,92±0,30 | 2,90±0,17 | 3,10±0,16 |
Выводы. Проведенное доклиническое исследование подострой токсичности препарата Субмастин-КРС согласно стандартному протоколу при его многократном применении лабораторным крысам в дозах 0,1 и 1,0 мл/кг показало отсутствие общетоксических эффектов: не зафиксированы отклонения в поведении, потреблении корма и воды, динамике массы тела и температуры. Исследуемый препарат не вызывал изменений относительной массы внутренних органов и их морфологической структуры. Многократное применение Субмастина-КРС не привело к появлению достоверных изменений в картине крови животных опытных групп со стороны морфологических и биохимических показателей. Таким образом, проведенное исследование не выявило токсического влияния препарата Субмастин-КРС на организм лабораторных крыс, что позволяет рекомендовать препарат для дальнейшего клинического исследования.
Список литературы:
Резюме. Воспаление молочной железы коров, возникающее на фоне негативных факторов внешней среды, в настоящее время остается актуальной проблемой и является причиной значительных экономических потерь на животноводческих комплексах. На сегодняшний момент одним из вариантов противомаститной терапии без применения антибиотиков является использование иммуностимулирующих препаратов на основе рекомбинантных интерферонов, обладающих широким спектром действия за счет активации иммунной системы. Субмастин-КРС представляет собой композицию из рекомбинантных цитокинов, видоспецифических для крупного рогатого скота, суммарной активностью не менее 104 МЕ, и витамина А (75000 МЕ), содержащихся в 1 мл препарата. Исследование общей токсичности лекарственных средств проводится с целью изучения доклинических свойств препарата и для дальнейшей оценки рисков при проведении клинических исследований. Целью работы было определение параметров токсичности препарата Субмас-тин-КРС в подостром опыте. В качестве тест-систем использовали здоровых половозрелых белых беспородных крыс обоего пола. Субмастин-КРС вводили в течение 30 дней ежедневно один раз в день в дозах 0,1 и 1,0 мл/кг (терапевтическая доза и в 10 раз ее превышающая). Общетоксическое действие препарата оценивали ежедневно по внешнему виду, общему состоянию, поведению, еженедельно по динамике массы тела, по окончании курса применения препарата Субмастин-КРС по гематологическим показателям и состоянию системы гемостаза. Проведенное доклиническое исследование подострой токсичности препарата Субмастин-КРС при его многократном применении крысам в дозах 0,1 и 1,0 мл/кг показало отсутствие общетоксических эффектов: не зафиксированы отклонения в поведении, потреблении корма и воды, динамике массы тела и температуры. Исследуемый препарат не вызывал изменений относительной массы внутренних органов и их морфологической структуры. Многократное применение Субмастина-КРС не привело к появлению достоверных изменений в картине крови животных опытных групп со стороны морфологических и биохимических показателей. Проведенное исследование не установило данных, препятствующих клиническому испытанию препарата Субмастин-КРС.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, мастит, Субмастин-КРС, рекомбинантные цитокины, доклинические исследования, подострая токсичность, белые крысы, общетоксическое действие, органы-мишени, морфология, биохимия крови, патоморфология.
Сведения об авторах:
Грицюк Василина Александровна, кандидат сельскохозяйственных наук, докторант, ведущий научный сотрудник отдела экспериментальной фармакологии ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии»; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова 114 б; тел.: 8-473-2539307; e-mail: vnivipat@mail.ru.
Востроилова Галина Анатольевна, доктор биологических наук, главный научный сотрудник отдела экспериментальной фармакологии ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии»; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114 б; тел.: 8-906-6781203; e-mail: gvostroilova@mail.ru.
Чаплыгина Юлия Алексеевна, младший научный сотрудник отдела экспериментальной фармакологии ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии»; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114 б; тел.: 8-951-5553510; e-mail: kantorovich.yuliya@mail.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Хохлова Нина Алексеевна, научный сотрудник отдела экспериментальной фармакологии ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии»; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114 б; тел.: 8-908-1376923; e-mail: nina_xoxlova@mail.ru.
http://vetkuban.com/num3_202102.html