УДК 619:579.841.1
Скориков А.В. ФГБНУ «Краснодарский научноисследовательский ветеринарный институт», г. Краснодар
Ярцев С.Н. ФКП «Армавирская биофабрика», Краснодарский край, Новокубанский район, пос. Прогресс
Введение. Инфекционные болезни свиней являются одной из важнейших проблем в свиноводческих хозяйствах различных форм собственности. Особое место в данной патологии занимают заболевания, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, которые в специальной литературе именуются факторными [1, 2].
Использование антибиотиков и других химиотерапевтических препаратов в свиноводстве привело не только к снижению их эффективности, но и образованию резистентных штаммов условно-патогенных микроорганизмов [6].
Среди данной группы микроорганизмов значительная этиологическая роль принадлежит синегнойной палочке Pseudomonas aeruginosa, вызывающей заболевания не только животных, но и людей [3, 4, 5].
В связи с вышеизложенным наряду с использованием средств антибактериальной терапии для лечения заболеваний свиней различных половозрелых групп, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, разработка средств их специфической профилактики данных заболеваний является актуальным и перспективным направлением современной науки.
Цель исследований - изучение биологических свойств штаммов P. аeruginosa, выделенных от больных поросят-сосунов.
Материалы и методы исследований. Работа по изучению морфологических тинкториальных, культуральных, ферментативных, вирулентных и серологических свойств изолятов Pseudomonas и штаммов данного возбудителя, изготовленных на Армавирской биофабрике, с последующей их лиофилизацией № 34 (О1), № 1 КВЛ (О3), № 9 (О4), № 6 (О6), № 10 (О11), № 25 (О19) проводилась с 2003 по 2013 годы в ветеринарных лабораториях Краснодарского края, Краснодарском НИВИ, ФГУП Армавирская биофабрика, лаборатории качества и стандартизации бактериальных лекарственных средств для ветеринарного применения, ФГБУ ВГНКИ.
Бактериологические исследования проводились в соответствии с «Методическими указаниями по лабораторным исследованиям на псевдомоноз животных и птиц» (1988), «Методическим рекомендациям по диагностике, профилактике животных» (2003), наставлением по применению системы индикации микроорганизмов Нижегородского предприятия по производству бактериальных препаратов, серотиповую принадлежность реакции агглютинации - с типоспецифическими сыворотками ГИСК им. Тросевича Л.А., патогенные свойства - по Вартанян Ю.П. (1978).
Результаты исследования. В ходе проведённых исследований установлено, что клетки штаммов P. aeruginosa представляют собой грамотрицательные, подвижные, короткие палочки, не образующие спор и капсул. Клетки штаммов при культивировании в течение 24-х часов при температуре 37°С на агаре Хоттингера формируют колонии сине-зеленого цвета (образуют пигмент пиоцианин), правильной округлой формы с ровными краями в «S''-форме, слизистой консис-18 тенции. На жидкой питательной среде бульоне Хоттингера в течение 24-х часового культивирования при температуре 37°С вызывают равномерное помутнение среды с окрашиванием в сине-зеленый цвет и образование пленки.
Таблица 1. Ферментативные свойства штаммов P. aeruginosa
| Название теста | Pseudomonas aeruginosa | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| № 34 (O1) | № 1 КВЛ (О3) | № 9 (О4) | № 6 (О6) | № 10 (O11) | № 25 (О19) | |
| Каталаза | + | + | + | + | + | + |
| Оксидаза | + | + | + | + | + | + |
| Уреаза | + | + | + | + | + | + |
| Индол | - | - | - | - | - | - |
| Сероводород | - | - | - | - | - | - |
| Глюкоза | + | + | + | + | + | + |
| Лактоза | - | - | - | - | - | - |
| Сахароза | - | - | - | - | - | - |
| Маннит | - | - | - | - | - | - |
| Арабиноза | + | + | + | + | + | + |
| Фруктоза | - | - | - | - | - | - |
| 3-галактозидаза | - | - | - | - | - | - |
| Лизин-декарбоксилаза | + | + | + | + | + | + |
| Инозит | - | - | - | - | - | - |
| Аргининдигидролаза | + | + | + | + | + | + |
| Фосфатаза | - | - | + | + | - | + |
| Ксилоза | + | + | + | + | + | + |
| Целлобиоза | - | - | - | - | - |
|
| Галактоза | + | + | + | + | + | + |
| Нитраты | - | - | - | - | - | - |
| Нитриты | + | + | + | + | + | + |
| Мальтоза | - | - | - | - | - | - |
| Цитрат Симмонса | + | + | + | + | + | + |
| 3-глюкозидаза | - | - | - | - | - | - |
| N ацетил-р D-глюкозаминидаза | - | - | - | - | - | - |
| Эскулин | - | - | - | - | - | - |
| у-глютамилтрансфераза | + | + | + | + | + | + |
| Трегалоза | - | - | - | - | - | - |
| Гемолиз | + | + | + | + | + | + |
Контроль на отсутствие контаминации посторонними микроорганизмами депонируемых штаммов проводили на питательных средах МПБ, МПА, Китт-Тароцци и Сабуро. Питательные среды с посевами инкубировали в термостате при температуре 37-38°С, на среде Сабуро при 20-22°С в течение 18-24 часов. Рост посторонней бактериальной и грибковой микрофлоры отсутствовал.
При определении ферментативных свойств штаммов P. aeruginosa в соответствии с наставлением по применению систем индикаторных бумажных для идентификации микроорганизмов (СИБ) Нижегородского госпредприятия по производству бактерийных препаратов проверяемые штаммы имели свойства, представленные в таблице 1.
Культуры штаммов Pseudomonas aeruginosa разжижали желатин, не свертывали и не пептонизировали молоко. Результаты определения патогенных свойств и расчет ЛД50 штаммов Pseudomonas aeruginosa № 34 (О1), № 1 KBJI (О3), № 9 (О4), № 6 (О6), № 10 (О11), № 25 (О19) для белых мышей представлены в таблицах 2, 3, 4, 5, 6 и 7.
Таблица 2. Определение ЛД50 штамма Pseudomonas aeruginosa № 34 (О1) для белых мышей
| № | Заражающая доза (м.к./см3) | Количество животных | Пало | % павших животных |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Физиологический раствор | 5 | 0 | 0 |
| 2 | 1Ч109 | 5 | 5 | 100 |
| 3 | 1Ч108 | 5 | 2 | 40 |
| 4 | 1Ч107 | 5 | 0 | 0 |
| 5 | 1Ч106 | 5 | 0 | 0 |
Определение ЛД50 штамма Pseudomonas aeruginosa № 34 (О1) для белых мышей составляет 1,26*108 микробных клеток.
Таблица 3. Определение ЛД50 штамма Pseudomonas aeruginosa № 1 КВЛ (О3) для белых мышей
| № | Заражающая доза (м.к./см3) | Количество животных | Пало | % павших животных |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Физиологический раствор | 5 | 0 | 0 |
| 2 | 1Ч109 | 5 | 5 | 100 |
| 3 | 1Ч108 | 5 | 1 | 20 |
| 4 | 1Ч107 | 5 | 0 | 0 |
| 5 | 1Ч106 | 5 | 0 | 0 |
ЛД50 штамма Pseudomonas aeruginosa № 1 КВЛ (О3) для белых мышей составляет 2,0*108 микробных клеток. Они могут быть депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в животноводстве и ветеринарии ФГБУ «ВГНКИ». Местом хранения и поддержания штаммов определено ФКП «Армавирская биофабрика».
Таблица 4. Определение ЛД50 штамма Pseudomonas aeruginosa № 9 (О4) для белых мышей
| № | Заражающая доза (м.к./см3) | Количество животных | Пало | % павших животных |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Физиологический раствор | 5 | 0 | 0 |
| 2 | 1Ч109 | 5 | 5 | 100 |
| 3 | 1Ч108 | 5 | 0 | 0 |
| 4 | 1Ч107 | 5 | 0 | 0 |
| 5 | 1Ч106 | 5 | 0 | 0 |
ЛД50 штамма Pseudomonas aeruginosa № 9 (О4) для белых мышей составляет 5,0*108 микробных клеток.
Таблица 5. Определение ЛД50 штамма Pseudomonas aeruginosa № 6 (О6) для белых мышей
| № | Заражающая доза (м.к./см3) | Количество животных | Пало | % павших животных |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Физиологический раствор | 5 | 0 | 0 |
| 2 | 1Ч109 | 5 | 5 | 100 |
| 3 | 1Ч108 | 5 | 0 | 0 |
| 4 | 1Ч107 | 5 | 0 | 0 |
| 5 | 1Ч106 | 5 | 0 | 0 |
Таблица 6. Определение ЛД50 штамма Pseudomonas aeruginosa № 10 (О11) для белых мышей
| № | Заражающая доза (м.к./см) | Количество животных | Пало | % павших животных |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Физиологический раствор | 5 | 0 | 0 |
| 2 | 1х109 | 5 | 5 | 100 |
| 3 | 1x108 | 5 | 2 | 40 |
| 4 | 1х107 | 5 | 0 | 0 |
| 5 | 1х106 | 5 | 0 | 0 |
ЛД50 штамма Pseudomonas aeruginosa № 10 (О11) для белых мышей составляет 1,26*108 микробных клеток.
Таблица 7. Определение ЛД50 штамма Pseudomonas aeruginosa № 25 (О19) для белых мышей
| № | Заражающая доза (м.к./см ) | Количество животных | Пало | % павших животных |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Физиологический раствор | 5 | 0 | 0 |
| 2 | 1Ч109 | 5 | 5 | 100 |
| 3 | 1Ч108 | 5 | 1 | 20 |
| 4 | 1Ч107 | 5 | 0 | 0 |
| 5 | 1Ч106 | 5 | 0 | 0 |
ЛД50 штамма Pseudomonas aeruginosa № 25 (О19) для белых мышей составляет 2,0*108 микробных клеток.
Серогрупповая принадлежность штаммов Р. aeruginosa по соматическому О-антигену в реакции агглютинации с моновалентными типоспецифическими сыворотками приведена в таблице 8.
Таблица 8. Серотипирование штаммов Pseudomonas aeruginosa в реакции агглютинации
| Антиген сыворотки | Титр | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| № 34 (01) | № 1 КВЛ (03) | № 9 (04) | № 6 (06) | № 10 (011) | № 25 (019) | |
| О1 | 1:1280 | <1:20 | <1:20 | <1:20 | <1:20 | <1:20 |
| О3 | <1:20 | 1:1280 | <1:20 | <1:20 | <1:20 | <1:20 |
| О4 | <1:20 | <1:20 | 1:1280 | <1:20 | <1:20 | <1:20 |
| О6 | <1:20 | <1:20 | <1:20 | 1:1280 | <1:20 | <1:20 |
| О11 | <1:20 | <1:20 | <1:20 | <1:20 | 1:1280 | <1:20 |
| О19 | <1:20 | <1:20 | <1:20 | <1:20 | <1:20 | 1:1280 |
По результатам исследования штаммов Р. aeruginosa в реакагглютинации установлено, что:
Заключение. Полученные результаты в ходе изучения биологических свойств штаммов P. aeruginosa позволяют сделать вывод о том, что их свойства соответствуют паспортным данным и они могут быть депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в животноводстве и ветеринарии, ФГБУ «ВГНКИ». Местом хранения и поддержания штаммов определено ФКП «Армавирская биофабрика».
Штаммы Pseudomonas aeruginosa № 34 (О1), № 1 КВЛ (О3), № 9 (О4), № 6 (О6), № 10 (О11), № 25 (О19) могут быть использованы для производства моно- и поливалентных вакцин против псевдомоно-за поросят и других репродуктивных половозрастных групп свиней с целью профилактики данной инфекции.
Список литературы:
Резюме. Представленны материалы по изучению биологических свойств штаммов Pseudomonas aeruginosa, отсекционированных из изоля-тов, полученных от больных поросят-сосунов и других половозрастных групп свиней из неблагополучных свиноводческих хозяйств Краснодарского края, в результате проведения бактериологических исследований патологического материала. Микробные клетки при культивировании на питательных средах формируют колонии сине-зеленого цвета, образуя пигмент пиоционин, S-формы слизистой консистенции. На жидких питательных средах культивирование в течение 24-х часов при температуре 37°С вызывает помутнение сред с окрашиванием их в сине-зеленый цвет и образованием пленки. Изучение ферментативных свойств штаммов Pseudomonas aeruginosa показали положительную реакцию на каталазу, оксидазу, пуриазу, глюкозу, арабинозу и других сахаров, а также на нитриты, цитрат Симонса У-глютомилтрансферазу и вызывали гемолиз, разжижали желатин, не пептонизировали молоко. Определение ЛД50 штаммов Pseudomonas aeruginosa: для белых мышей № 34 (О1) составляет I, 26х108 микробных клеток, № 1 КВЛ (О3) - 2,0х108 микробных клеток, № 9 (О4) - 5,0х108 микробных клеток, № 6 (О6) - 5х108 микробных клеток, № 10 (О11) - 1,26х108 микробных клеток, № 25 (О19) - 2,0х108 микробных клеток. Штаммы P. aeruginosa принадлежат к серогруппе О1, № 1 КВЛ - О3, № 9 - О4, № 6 - О6, № 10 - О11, № 25 - О19. Результаты проведенных исследований по изучению биологических свойств P. aeruginosa свидетельствует о том, что штаммы данного микроорганизма по морфологическим, тинкториальным, культуральным, ферментативным, вирулентным и серологическим свойствам соответствуют паспортным данным, и могут быть депонированы во Всероссийскую Государственную коллекцию штаммов микроорганизмов. А также возможно их использование в качестве производственных штаммов для изготовления моно- и поливалентных вакцин против псевдомоноза свиней.
Ключевые слова: Pseudomonas aeroginosa, свиньи, инфекция, болезни, условно-патогенные микроорганизмы, разработка, специфическая, профилактика, культуры, изоляты, штаммы, биологические свойства, депонирование, технология, изготовление, вакцины, коллекция.
Сведения об авторах:
Ярцев Сергей Николаевич, заместитель директора ФКП «Армавирская биофабрика»; 352212, Краснодарский край, Новокубанский район, п. Прогресс, ул. Мечникова, д.11; тел.: 8-86195-4-10-25; e-mail: aarm_bio@mail.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Скориков Александр Владимирович, кандидат биологических наук, заместитель директора по научной работе ФГБНУ «Краснодарский научно-исследовательский институт»; 350004, г. Краснодар, ул. 1-я Линия, 1; тел.:8-861-221-60-84; e-mail: knivi@list.ru.
http://vetkuban.com/num3_201705.html