УДК 619:616:07.68.41.05
Мельник Н.В. «Национальная Ассоциация ветеринарно-биологической промышленности» («Ветбиопром»), г. Москва
Крюкова Е.Н., Литенкова И.Ю., Фёдорова О.Ю. ФКП «Щелковский биокомбинат», г. Щелково
Самуйленко А.Я., Мельник Р.Н., Гринь С.А., Клюшинцева Н.С. ФГБНУ «Всероссийский научно исследовательский и
технологический институт биологической промышленности», г. Москва
Введение. Для нормального функционирования необходимо, чтобы при движении в сосудах эритроциты не сближались и не склеивались. Взаимоотталкивающая сила обеспечивается величиной их одноименного отрицательного заряда. Эритроциты образуются в красном костном мозге. Продолжительность их жизни у крупного рогатого скота - 120-160, у овец - 130, у лошадей - 100, у свиней и кроликов - 45-60 дней.
Целью работы явилось изучение вопросов использования эритроцитов крови животных в конструировании эритроцитарных диаг-ностикумов для создания быстрых, простых и экономических методов биологической экспресс-индикации микроорганизмов. Опубликовано немало статей о получении и применении эритроцитарных диагности-кумов. Изготовление эритроцитарных диагностических препаратов и их применение в ветеринарной практике является весьма актуальной темой. Экспресс-диагностика болезней животных все шире входит в повседневную практическую работу клинико-диагностических лабораторий, вытесняя устаревшие громоздкие и трудоемкие методы. В этом плане наиболее перспективна реакция непрямой гемагглютина-ции (Indirect hemagglutination test) с антигенными диагностикумами. Эта реакция проста по технике постановки и позволяет значительно быстрее выявлять антитела по сравнению с традиционно используемыми реакциями. Сущность указанной реакции заключается в том, что эритроциты животных после адсорбции на их поверхности антигенов различной природы приобретают новую серологическую специфичность, вследствие чего могут агглютинироваться в присутствии специфических антител. Эта реакция испытана при диагностике ряда бактериальных и вирусных инфекций, в том числе и при бруцеллезе.
Диапазон разработок в этой области необычайно велик. В настоящее время разработаны различные методы изготовления эритроцитарных диагностикумов, отличающихся по способам сенсибилизации эритроцитов (с помощью танина, глютарового альдегида, хлористого хрома, риванола) [1, 5].
Разработка диагностических тестов для мониторинга иммунного фона у животных дает возможность ветеринарным врачам своевременно организовать профилактические мероприятия, а специалистам лабораторий проводить экспресс-диагностику инфекций и оценивать качество опытных и производственных серий вакцинных препаратов [2, 3, 4].
Постоянное изучение этиологической структуры желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных в различных регионах страны является вопросом первостепенной важности, определяющим эффективность серологической диагностики и специфической профилактики этих инфекций.
Разработка новых диагностических тестов достаточно чувствительных и простых в исполнении и стандартизированных для проведения эпизоотологического обследования, иммунологического мониторинга и изучения эффективности специфических мероприятий против сальмонеллеза является весьма актуальной задачей, так как до настоящего времени на практике применяется реакция агглютинации, которая является недостаточно чувствительной и специфичной.
В этой связи представляется актуальной разработка более специфического и чувствительного метода, каковым является реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Использование антигенного эритроцитарного диагностикума позволит проводить серологическую диагностику сальмонеллеза, а также проводить оценку иммунного ответа на фоне применяемых ассоциированных и моновалентных вакцин против желудочно-кишечных заболеваний. Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещества, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко.
В серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции пассивной гемагглютинации, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы. Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации.
Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты, обработанные танином или формалином, с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях, в тканях, применяют «антительные диагностикумы», то есть эритроциты, сенсибилизированные антителами.
Известны многие методы лабораторной диагностики ВГБК, такие как реакция гемагглютинации (РГА), реакция длительного связывания комплемента (РДСК), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция иммуноферментного анализа (ИФА). Однако в некоторых случаях применение этих методов не дает четких результатов, например при исследовании разложившихся патматериалов или объектов ветсаннадзора. Кроме того, перед постановкой реакции требуется предварительное приготовление суспензии органов, что достаточно трудоемко.
Диагностикум используется в РТГА и РСК с сывороткой больных при диагностике заболевания.
Материалы и методы исследований. Работа выполнена в 2016-2017 годах в соответствии с изучением литературных данных, как отечественных, так и зарубежных авторов, и собственных исследованиях на производственной базе ФКП «Щелковский биокомбинат» и ФГБНУ «ВНИТИБП».
Процесс изготовления диагностикумов включает: стабилизацию эритроцитов формальдегидом, обработку фиксированных эритроцитов танином, сенсибилизацию специфическим антигеном, консервирование сенсибилизированных эритроцитов.
Стабилизация эритроцитов формальдегидом. Для приготовления эритроцитарного диагностикума используют эритроциты барана, формалинизированные по методу Вайнбаха в модификации Меньшова и Шмутера. Для приготовления эритроцитарного диагностику-ма используют эритроциты барана, формалинизированные по методу Вайнбаха в модификации Меньшова и Шмутера.
С этой целью дифибринированную кровь барана центрифугируют при 1500-2000 об/мин с экспозицией 10 минут. Полученный осадок эритроцитов трижды отмывают 0,85% физиологическим раствором путем ценрифугирования при 1500-2000 об/мин в течение 20 минут. Из осадка готовят 8%-ную взвесь эритроцитов на физиологическом растворе. К 150 мл 8%-ной взвеси эритроцитов капельно добавляют при постоянном перемешивании равный объем изотонического раствора формалина (рН 7-7,2), содержащего 3% формальдегида. Смешивание происходит на магнитной мешалке, после чего смесь помещают в термостат при 37-38°С на 16 часов. По истечении времени выдерживания в термостате формалинизированные эритроциты фильтруют через 2-3 слоя рыхлой ваты и трижды отмывают центрифугированием десятикратным объемом физиологического раствора при 1500 об/мин по 10 минут. Осадок ресуспензиру-ют физиологическим раствором хлористого натрия в 5%-ную взвесь эритроцитов и консервируют 1%-ным раствором формалина. Эритроциты, обработанные описанным способом, сохраняются при 4°С не менее 6-ти месяцев, не лизируются в гипотоническом растворе поваренной соли и практически не обладают способностью агглютинироваться гетерофильными антителами.
Обработка формалинизированных эритроцитов танином. С этой целью берут равные объемы (1:1) раствора танина (1:20000) и 5%-ной взвеси эритроцитов. Обе части смеси нагревают в термостате или водяной бане при 37оС, затем тщательно смешивают и выдерживают при этой же температуре 15 минут. После этого обработанные танином эритроциты 3-4 кратно отмывают от избытка танина в шестикратном объеме ФБР (рН 7,2) с помощью центрифугирования при 2000 об/мин в течение 10-ти минут. Отмытые эритроциты собирают с центрифужных пробирок и доводят их до первоначального объема (5%-ная взвесь) 5%-ным раствором хлорида натрия и туда же вносят 0,25%-ный детергент вторичного алкилсульфата натрия с рН = 6,2-6,4.
Сенсибилизация формалинизированных и танизирован-ных эритроцитов R-антигеном. Антиген для сенсибилизации эритроцитов готовят из штамма B. ovis 63/290 путем предварительного замораживания при температуре -20°С, после чего оттаивают с последующим воздействием на бруцеллезную взвесь ультразвуковых волн частотой 22 кГц и мощностью 90 Вт/см2 трехкратно в течение 15-ти минут, затем бактериальную взвесь подвергают центрифугированию при 6000 об/мин в течение 30 минут, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость декантируют и используют в качестве сен-ситина на эритроциты.
Для определения минимальной сенсибилизирующей дозы R-антигена (сенситина) проводят его сенсибилизацию возрастающими дозами, при температуре 45-50°С, в течение одного часа, при периодическом встряхивании каждые 5-8 минут. За 10 минут до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют формалин из расчета 1 см3 на 200 см3 смеси. Для этого в пробирки с 1 см3 5%-ной взвеси эритроцитов добавляют 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5... до 4,0 см3 R-антигена, смесь перемешивают и выдерживают на водяной бане в течение одного часа при 45-50°С. Затем сенсибилизированные эритроциты отмывают от избытка R-антигена в течение 30 минут трехкратно физиологическим раствором с добавлением к нему 1%-ной нормальной инактивированной кроличьей или 2,5%-ной лошадиной сыворотки крови.
Физиологический раствор для отмывания берут в десятикратном объеме. Затем в каждую пробирку с осадком отмытых сенсибилизированных эритроцитов вносят по 2 см3 физиологического раствора со стабилизатором (свежая кроличья или лошадиная сыво-16 ротка крови). Полученные 2,5%-ные взвеси эритроцитов, сенсибилизированные разными дозами R-антигена (R-сенситина), гомогенизируют встряхиванием пробирок и проверяют в РНГА на активность и специфичность.
Консервирование сенсибилизированных эритроцитов. После приготовления для консервации применяют 0,3%-ный формальдегид. Готовый препарат хранят в холодильнике при 4-6°С.
Проверка активности и специфичности полученного эритроцитарного R-антигенного диагностикума в РНГА. Эритроцитарный антигенный диагностикум проверяют на активность и специфичность с заведомо известными позитивными, негативными сыворотками. Берут положительную, отрицательную сыворотки разводят их физиоло-гиче-ским раствором с добавлением в качестве стабилизатора сыворотки крови кролика 1% или лошади 2,5%.
Преимущество диагностикумов перед живой культурой заключается в стабильности их агглютинабильных свойств, стандартности, безопасности и простоте обращения с ними. Использование диагности-кумов дает возможность широко применять серологические методы в практике массовой работы. Особое значение имеют диагностикумы в случаях, когда работа с живыми бактериями или вирусами опасна из-за их высокой инфекционности (например, с бруцеллами, туляремий-ными бактериями, вирусами клещевого и японского энцефалитов). Диагностикумы. используемые для распознавания инфекционных заболеваний, делятся на бактерийные, риккетсиозные и вирусные. С их помощью в сыворотке больных можно определить наличие антител по отношению к определенному виду микроба-возбудителя.
Заключение. Ежегодно в нашей стране миллионы людей и сельскохозяйственных животных болеют различными инфекциями. Экономический ущерб от этих заболеваний огромен. В связи с этим, одним из важных этапов борьбы с инфекциями является их ранняя диагностика. Наиболее длительным и трудоемким этапом микробиологического исследования при проведении лабораторной диагностики того или иного инфекционного заболевания является изучение биохимических свойств патогенных микробов. Каждый микроорганизм характеризуется специфическим спектром ферментов. Поэтому изучение биохимической активности микроорганизмов играет важную роль в лабораторной практике при идентификации микроорганизмов. Биохимическая активность положена в основу их классификации и всегда используется для установления родовой и видовой принадлежности выделяемых возбудителей. Бурный научно-технический прогресс во всех областях знаний, в том числе и в области микробиологических исследований, сопровождается разработкой и созданием быстрых, простых и экономичных методов биохимической экспресс-индикации микроорганизмов.
Список литературы.
Резюме. К форменным элементам крови относят эритроциты, лейкоциты и кровяные пластинки (тромбоциты). Эритроциты - красные клетки крови, свое название получили от греческого слова эритрос - красный. Каждый в отдельности эритроцит - зеленовато-желтый цвет, а в толстом слое все вместе приобретают красный цвет. У млекопитающих животных эритроциты безъядерные, а в связи с выталкиванием ядра на определенной стадии своего развития приобретают форму двояко-вогнутого диска, благодаря чему в 1,64 раза увеличивается их поверхность по сравнению с поверхностью шара, что создает благоприятные условия для диффузии газов через их оболочку. Поверхность эритроцитов большая и составляет 27-32 м2/кг массы животного. У птиц, амфибий, рептилий и рыб эритроциты овальной формы и содержат ядро. Эритроциты животных других видов имеют тонкую, сетчатую строму (остов), ячейки которой заполнены гемоглобином. Белково-липоидная оболочка эритроцитов обладает избирательной способностью к проникновению разных веществ, благодаря чему эритроциты сохраняют свой постоянный химический состав. Оболочка легко пропускает газы, воду, анионы хлора, угольной кислоты, глюкозу, мочевину, но через нее не проходят белки, гемоглобин и катионы, а ионы натрия и калия проникают очень медленно. Эритроциты очень эластичны, могут менять свою форму и проникать в капилляры, диаметр которых меньше диаметра эритроцитов. Эритроциты выполняют следующие функции: перенос кислорода от легких к тканям и углекислого газа от тканей к легким; транспортируют по организму адсорбированные на их поверхности аминокислоты, липиды; за счет наличия гемоглобина в поддержании постоянства реакции крови; адсорбируют яды, токсины, переносят их в систему мононуклеарных фагоцитов, где они нейтрализуются. Авторами изучены вопросы использования эритроцитов крови животных в конструировании эритроцитарных диагностикумов для создания быстрых, простых и экономических методов биологической экспресс-индикации микроорганизмов.
Ключевые слова: форменные элементы крови, эритроциты, животные, диагностические тесты, сенсибилизированные эритроциты, эритроцитарные диагностикумы, растворы: формалин, танин.
Сведения об авторах:
Мельник Николай Васильевич, доктор ветеринарных наук, профессор, президент Национальной Ассоциации ветеринарно-биологической промышленности (Ассоциация «Ветбиопром»); 107139, г. Москва, ул. Садово-Спасская, д. 11/1; тел.: 8-499-9754966; e-mail: a-vbp@mail.ru.
Крюкова Елена Николаевна, кандидат биологических наук, заместитель директора по развитию и маркетингу ФКП «Щелковский биокомбинат»; 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; тел.: 8-495-1345885 (доб. 107); e-mail: comerc@biocombinat.ru.
Литенкова Ирина Юрьевна, кандидат ветеринарных наук, главный технолог научно-исследовательской работы ФКП «Щелковский биокомбинат»; 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; тел.: 8-495-1345885 (доб. 107); e-mail: litenkova2012@mail.ru.
Фёдорова Ольга Юрьевна, старший микробиолог ФКП «Щелковский биокомбинат», 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; тел. 8-495-1345885 (доб. 107); e-mail: comerc@biocombinat.ru.
Самуйленко Анатолий Яковлевич, доктор ветеринарных наук, академик РАН, директор ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологический промышленности»; 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; тел.: 8-496-5673263; e-mail: vnitibp@mail.ru.
Гринь Светлана Анатольевна, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по технологическим вопросам и нанотехнологиям ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности»; 141142, Московская область, Щелковский район, п. Биокомбината; тел.: 8-496-5673263; е-mail: vnitibp@mail.ru.
Клюшинцева Наталья Сергеевна, соискатель ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности»; 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; е-mail vnitibp@mail.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Мельник Роман Николаевич, кандидат биологических наук, заведующий отделом ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологический промышленности»; 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; тел.: 8-496-5673263; e-mail: mromanos@mail.ru.
http://vetkuban.com/num3_201704.html