Понкало Л.И., Вищур О.И.
Институт биологии животных НААН, Украина, г. Львов
Сухостойный период у коров, а особенно последний месяц стельности, является одним из критических физиологических периодов, который существенно влияет на состояние иммунной системы их организма. Это, прежде всего, связано с интенсивным ростом плода, окончанием процессов формирования его органов и тканей [3]. Формирование полноценного иммунного ответа у новорожденных телят зависит от иммуногенетических особенностей матери, особенностей течения беременности, родов, а также от полноценности кормления коров в сухостойный период. Т- и В-лимфоцитам крови принадлежит ведущая роль в формировании иммунитета. Активация лимфоцитов представляет собой сложный биохимический процесс, связанный с распознаванием антигена, и происходит непосредственно с участием имеющихся на мембранах лимфоцитов специфических антигенных рецепторов [8].
Для повышения адаптационной способности и иммунобиологической реактивности организма, в последние годы с успехом используются витамины, аминокислоты, микроэлементы, обладающие иммунотропными свойствами, стимулирующие активность иммунной и антиоксидантной систем, продуктивность и сохранность у животных [2, 5]. Однако, эти данные фрагментарны и требуют детального изучения. Целью наших исследований стало выяснение влияния витаминов (А, D3, Е), лизина, метионина отдельно с уксуснокислым цинком или селенита натрия в форме липосомальной эмульсии на количество и функциональную активность Т- и В-клеточного звеньев иммунитета у коров в последний месяц стельности и в первые дни после отела, а также у рожденных от них телят, что и было целью наших исследований.
Материалы и методы. Исследования проводились в одном из фермерских хозяйств Жидачевского района Львовской области на трех группах коров 3-4 лактаций украинской черно-пёстрой молочной породы последнего месяца стельности, разделенных по принципу аналогов по пять животных в каждой. Коровам I группы (контрольной), за месяц до предполагаемых родов, внутримышечно вводили изотонический раствор натрия хлорида, животным II группы (опытной), соответственно: витамины (А, Д3, Е), лизин, метионин и цинк уксуснокислый, животным III группы (опытной) - комплекс указанных витаминов, лизин, метионин и селенит натрия. Исследуемые факторы в форме липосомальной эмульсии вводили коровам в последний месяц стельности парентерально дважды с интервалом 10 дней в дозе 0,02 мл / кг массы тела. Витамины А, Д3, Е, лизин, метионин, цинк и селен в составе препарата вводили в лечебно-профилактических дозах. Материалом для исследований послужила кровь, которую брали из яремной вены коров за 30 -, 25 - и 20 дней до предполагаемых родов и в первый и третий день после отела. У телят, рождённых от коров контрольной и опытных групп, кровь брали из яремной вены на третий день после рождения.
В стабилизированной гепарином крови определяли общее количество Т-лимфоцитов (ТО-РОЛ) - в реакции спонтанного розетко-образования с эритроцитами козы (Jondal M. et al., 1972), их субпопуляции - Т-хелперы (Т11-Т-РОЛ; Суровас В. М. с соавт., 1980), количество Т-лимфоцитов с преимущественно супрессорной активностью Тs-РОЛ) - путем вычитания числа теофиллин-резистентных Т-клеток (Т11) от общего количества Т-лимфоцитов, В-лимфоциты (ЕАС-РОЛ - в реакции комплементарного розеткообразования с эритроцитами козы (Чернушенко Е.Ф. с соавт., 1979). При подсчете количества Т-и В-лимфоцитов и их регулятор-ных субпопуляций на фиксированных и окрашенных мазках крови определяли лимфоциты с низкой (3-5), средней (6-10) и высокой (M) плотностью рецепторов. Цифровой материал обрабатывали путем вариационной статистики с использованием статистических программ "Microsoft Office Excel, 2007".
Таблица 1. Количество ТО-РОЛ и их функциональная активность в крови исследуемых коров и рожденных от них телят (М± m; n = 4-6)
| т-лимфоциты, авидностъ | Группы | Периоды исследований | Телята тpexдневного возраста | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| за 30 дней до отела | за 25 дней до отела | за 20 дней до отела | 1-ый день после отела | 3-ий день после отела | |||
| ТО- РОЛ, 0 | I | 37,50±0,76 | 39,00± 1,08 | 40,00± 1,08 | 56,25± 0.85000 | 51,00±1,29 000 | 56,25±0,63 |
| II | 37,80±0,86 | 36,00±1,03* | 50,00±1,30** | 4530±1,69* | 42,00±1,00*** | ||
| III | 37,60±1,03 | 35,00±1,30* | 48,00±1,22*** | 43,80±2,33* | 38,60±1.03*** | ||
| 3-5 | I | 43,50±0,43 | 43,50±0,65 | 40,25±0.8500 | 16,50±1,04 000 | 26,00±1,47 000 | 32,001 0,91 |
| II | 44,40±0,93 | 37,80± 0.6 | 21,40±0,81*** | 27,00±1,52 | 35,20±0,58* | ||
| III | 42,80±0,86 | 37,80±0,86 | 27,40±1,21*** | 27,00±0,95 | 34,00±0,71 | ||
| 6-30 | I | 11,33±0,42 | 11,50±0,65 | 14,25+ 0,85 0 | 14,00±1,58 | 14,00±1,47 | 8,50±1,19 |
| II | 11,80±0,58 | 1930±0,86** | 14,40±0,93 | 17.80±0,66 | 16.80±139** | ||
| III | 12,00±0,71 | 21,80±0,58*** | 10,20±0,86 | 17,00±0,89 | 16,60±1.08*** | ||
| М | I | 7,67±0,61 | 6,00±1,47 | 6,67±0,88 | 13,25±1.31 00 | 9,00±1,290 | 3,00±0,58 |
| II | 530±0,58 | 6,40±0,93 | 14,20±0,37 | 9,40±1,36 | 4,75±1,29 | ||
| III | 7,60±0,68 | 4,33±0,66 | 14,401 1,08 | 12,00±1,67 | 10,80±0,86*** | ||
| % | I | 62,50±0,76 | 61,00±1,08 | 60,00±1,08 | 43,75±0.35 000 | 49,00±1,29 000 | 43,85±1,11 |
| II | 62,20±0,86 | 64,00±1,03* | 50,00±1,30** | 54,20±1,69* | 58,00±1,00*** | ||
| III | 62,40±1,03 | 65,00±1,30* | 52,00±1,22*** | 56,20±2,33* | 61,00±1.03*** | ||
Примечание: р<0,05; ** - р<0,01; *** - р <0,001 у животных опытной группы по сравнению с контрольной, 0 - р<0,05; 00 - р<0,01; 000 - р<0,001 разницы статистически достоверные по сравнению к 30-суткам до отела;
Результаты и обсуждение. Из приведенных в таблице 1 данных видно, что общее количество ТО-РОЛ в крови коров контрольной группы с увеличением срока беременности существенно не меняется. Причем, в первые и третьи сутки после отела общее количество ТО-РОЛ в крови коров контрольной группы было, соответственно, на 18,75 (р<0,001) и 13,50 % (р<0,01) меньше, а активность высокоавидных ТО-РОЛ в 1,9 (р<0,01) и 1,3 раза (р<0,05) больше, чем за месяц до отела. Эти данные свидетельствуют о том, что после родов в крови коров контрольной группы снижается общее количество Т-лимфоцитов, однако растет их функциональная активность, что может быть компенсаторной реакцией организма на действие стрессового фактора.
Указанные изменения в крови коров опытных групп происходили за счет увеличения количества ТО-РОЛ со средней (за 20 дней до отела) и низкой (1-й день после отела) плотностью рецепторов и уменьшением количества "нулевых", недифференцированных в функциональном отношении Т-лимфоцитов. У телят, родившихся от коров второй и третьей групп, общее количество Т-лимфоцитов было, соответственно, на 14 и 17 % (р<0,001) больше, чем в контрольной. Указанные изменения данной популяции лимфоцитов происходили за счет роста в крови телят количества Т-лимфоцитов с низкой, средней и высокой плотностью рецепторов (р<0,05-0,001) и уменьшения количества недифференцированных ТО-РОЛ. Увеличение количества и функциональной активности ТО-РОЛ в крови коров опытных групп, а также рожденных от них телят, можно объяснить стимулирующим влиянием комплекса витаминов, аминокислот и микроэлементов, входящих в состав исследуемых препаратов.
Таблица 2. Количество Тп-и Тв-лимфоцитов в кров исследуемых коров и их телят (М±m; n = 4-6)
| T-лимфоциты, авидность | Группы | Периоды исследований | Телята трехдневного возраста | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| за 30 дней до отела | за 25 дней до отела | за 20 дней до отела | 1-ый день после отела | 3-ий день после отела | |||
| Th Хелперы,0 | I | 59,00± 0,58 | 61,50±0,87° | 63,50±0,8700 | 80,00±1,08 000 | 64,75±0.4 000 | 69,00±0,41 |
| II | 59,80±0,68 | 54,00±0,45*** | 67,60±1,63*** | 62,00±0,89* | 59,40±0,93*** | ||
| III | 62,00±0,55 | 52,00±0,84*** | 64,20±1,69*** | 60,00±1,14** | 59,00±1,18*** | ||
| 3-5 | I | 30,67±0,47 | 31,75±0,95 | 25,25+0.95 000 | 10,75±0,85000 | 18,25±1,28 °00 | 23,25±1,19 |
| II | 3 1,22 | 27,20±0,80 | 17,40±0,93*** | 18,80±1,77 | 33,20±0,58*** | ||
| III | 30,80±0,86 | 23,80±0,25 | 20,20±0,58*** | 20,00±0,89 | 30,60±1,81* | ||
| 6-10 | I |
| 5,00±0,41 | 7,00±1,08 | 7,00±1,08 | 11,00±0,91 000 | 6,25±0,48 |
| II | 6,00±0,37 | 5,20±0,58 | 12,20± 1,09* | 9,00± 0,84 | 16,00±1,26* | 5,40±0,51 | |
| III |
| 5,80±0,37 | 17,20±0,58*** | 10,20±0,58* | 13,40±1,12 | 7,00±1,09 | |
| M | I | 4,33±0,33 | 1,75±0,750 | 4,25±0,25 | 2,67±0.3 00 | 5,33±0,93 | 2,50±0,50 |
| II | 3,25±0,48 | 6,60±1,28 | 7,00±0,71** | 3,50±0,29* | 1,80±0,37 | ||
| III | 3,25±0,45 | 7,20±0,49* | 6,75±0,94** | 6,60±0,40 | 3,40±0,92 | ||
| % | I | 41,00±0,58
| 38,50±0,87° | 36,50±0,87*** | 20,00±1.08 000 | 35,25±0.48 000 | 31,00±0,41 |
| II | 40,20±0,66 | 46,00±0,45*** | 32,40±1,63*** | 38,00±0,89* | 40,60±0,93*** | ||
| III | 39,40±0,81 | 48,00±0,84*** | 35,40±1,60*** | 40,00±1,14** | 41,00±1,18*** | ||
| Ts Суn Ресоры | I | 21,50±0,99 | 22,50±1,51 | 23,50±0,65 | 23,75±1,44 | 13,75±1,18000 | 12,75±0,85 |
| II | 22,00±1,14 | 18,00±1,51* | 17,60±2,20 | 16,20±2,05 | 17,40±1,53* | ||
| III | 23,00±1,41 | 17,00±1,67** | 16,20±2,56* | 16,20±1,77 | 20,40±1,63** | ||
| IPI | I | 1,93±0,11
| 1,74±0,15 | 1,55±0,060 | 0,89±0,29 000 | 2,61±0,21 0 | 2,46±0,18 |
| II | 1,86±0,13 | 2,63±0,23* | 1,97±0,28* | 2,54±0,41 | 2,43±0,29 | ||
| III | 1,74±0,13 | 2,95±0,35** | 1,93±0,25* | 2,40±0,18 | 2,09±0,28 | ||
Примечание: 0 - "нулевые", недифференцированные в функциональном отношении лимфоциты; 3-5 - низкоавидные лимфоциты; 6-10 - среднеавидные лимфоциты, М - высокоавидные лимфоциты.
При определении количества теофиллинрезистентной популяции Т-лимфоцитов в крови исследуемых животных контрольной и опытной групп выявлены изменения, как и при определении ТО-РОЛ. Из приведенных в таблице 2 данных видно, что в крови коров контрольной группы в первые сутки после отела общее количество ТИ-лимфоцитов, а также теофиллинрезистентных Т-лимфоцитов с низкой плотностью рецепторов было достоверно меньше, а недифференцированных - больше, чем их количество в крови коров до отела, что свидетельствует о иммуносуп-рессивном влиянии родов на количество и функциональную активность указанной популяции Т-лимфоцитов. При этом, необходимо отметить, что уже на третьи сутки после отела количество Т-лимфоцитов-хелперов в крови коров контрольной группы достигает уровня, обнаруженного до отела. Вместе с тем, в указанный период исследований в крови коров контрольной группы количество Те была меньше (р<0,001), чем за 30 дней до отела. Проведенные исследования показали (табл. 2), что общее количество теофилрезистентных Т-лимфоцитов в крови коров обеих опытных групп за 20 суток до отела, в 1-е и 3-и сутки после отела, а также у рожденных от них телят, было больше (р<0,05-0,001), чем в контрольной.
В указанные периоды исследований в крови коров обеих опытных групп при распределении авидности выявлено большее количество Т-лимфоцитов-хелперов с низкой и высокой плотностью рецепторов и меньшее количество недифференцированных клеток. При этом, необходимо отметить, что количество теофиллинчувствительных Т-лимфоцитов в крови коров опытных групп было меньше, чем в контрольной. Разницы оказались достоверными по сравнению с контролем в крови коров обеих опытных групп за 20 суток до отела и у коров третьей группы в первые сутки после отела. Иммунорегуляторный индекс, который характеризует соотношение Th к Ts, был больше в крови коров второй (р<0,05) и третьей (р<0,001) групп, по сравнению с контрольной, за 20 суток до отела.
Полученные результаты исследований свидетельствуют о стимулирующем влиянии исследуемых факторов в составе липосомальных эмульсий на количество и функциональную активность Т-лимфоцитов-хелперов. При этом в крови коров опытных групп растет иммунорегуляторный индекс, что указывает на активность гуморального звена иммунитета.
Исследование В-лимфоцитов характеризует уровень гуморального звена иммунитета. Как видно из полученных результатов (табл. 3.), количество EAC-РОЛ в крови коров контрольной группы в 1-е и 3-и сутки после отела было меньше, чем за 30 дней до отела, что указывает на иммуносупрессивное влияние родов на активность гуморального звена иммунного ответа организма животных.
Таблица 3. Количество EAC-РОЛ в крови исследуемых коров и их телят (M±m; n=4-6)
| Т-лимфоцит, авидность | Группы | Периоды исследований | Телята | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| за 30 дней до отела | за 25 дней до отела | за 20 дней до отела | 1-ый день после отела | 3-ий день после отела | трехдневного возраста | ||
| 0 | I | 59,50±0,76 | 59,00±1,08 | 58,00±1,08 | 67,75±1.11 000 | 65,75±1.11 000 | 65,00±1,29 |
| II | 57,80±0,86 | 49,80±1,39** | 58,20±1,59** | 58,00±1,22** | 63,80± 1,28 | ||
| III | 57,60±1,03 | 49,00±1,30*** | 59,40±1,08*** | 54,20±1,39*** | 59,80±1,28* | ||
| 3-5 | I | 31,50±0,43 | 29,25±0,850 | 30,50±0,65 | 15,75±0,85000 | 21,75±0,85000 | 28,25±1,25 |
| II | 30,20±1,08 | 34,00±1,00* | 21,00±0,71** | 24,00±0,71 | 27,40±1,08 | ||
| III | 31,60±0,93 | 32,20±0,73 | 27,20±0,86*** | 27,20±2,01* | 29,40±0,93 | ||
| 6-10 | I | 5,50±0,56 | 8,00±0,910 | 8,75±0,6300 | 10,50±2,070 | 9,25±0,8500 | 4,85±0,85 |
| II | 7,00±0,71 | 10,80±0,66 | 11,00±0,71 | 11,20±0,80 | 6,20±0,86 | ||
| III | 7,80±1,02 | 12,20±0,86* | 7,80±0,73 | 12,60±1,72 | 6,60±0,60 | ||
| М | I | 3,50± 0,56 | 3,75± 0,85 | 3,25± 0,62 | 3,50± 1,32 | 3,25± 0,95 | 2,66± 0,88 |
| II | 5,00± 0,84 | 5,40± 0,81 | 7,20± 0,58* | 6,60± 0,93* | 2,60± 0,68 | ||
| III | 3,20± 0,86 | 6,60± 0,51** | 5,60± 0,87 | 6,00± 1,41* | 4,20± 0,73 | ||
| % | I | 40,50±0,76 | 41,00±1,08 | 42,00±1,08 | 32,25± 1 ц000 | 34,25± 1 ц000 | 35,00± 1,29 |
| II | 42,20±0,86 | 50,20±1,39** | 39,80±1,16** | 41,80±1,24** | 36,20±1,28 | ||
| III | 42,40±1,03 | 51,00±1,30*** | 40,60±1,08*** | 45,80±1,39*** | 41,40±2,04* | ||
По степени дифференциации В-лимфоцитов в крови коров контрольной группы в указанный период исследований выявлено большее количество среднеавидных и "нулевых" EAC-РОЛ и меньшее количество низкоавидных популяций клеток (р<0,05-0,001). У коров второй и третьей групп, относительное количество В-лимфоцитов в крови за 20 дней до отела, а также в 1-е и 3-и сутки после отела было больше (р<0,01-0,001), чем в контроле. При этом в крови коров обеих опытных групп, по сравнению с контрольной, повышается число антителопродуцирующих В-клеток с низкой, средней и высокой плотностью рецепторов и уменьшается количество "нулевых" клеток (р<0,01-0,001).
В крови телят, полученных от коров третьей группы, которым в последний месяц стельности вводили витамины А, Д3, Е, лизин, метионин и селенит натрия в форме липосомальной эмульсии количество В-лимфоцитов было больше (р<0,05), а недифференцированных - меньше (р<0,05), чем в контрольной. Увеличение количества EAC-РОЛ в крови коров и рожденных от них телят можно объяснить комплексным действием исследуемых факторов на количество тео-филлинрезистентной популяции Т-лимфоцитов, которые активируют лимфопоэз и дифференциацию В-лимфоцитов.
Итак, проведенные исследования показали повышение количества и функциональной активности Т- и В-лимфоцитов в крови коров и их телят. Это можно объяснить, как прямым, так и опосредованным влиянием витаминов А, Д3, Е, лизина, метионина, цинка и селена на экспрессию Т- и В-лимфоцитов в плазматические мембраны. О чем также свидетельствуют результаты исследований других авторов, в частности, обнаружено, что витамины А, Д, Е, цинк, селен работают в синергизме с защитной активностью иммунных клеток [1]. Все эти элементы, необходимы для продукции антител. Установлено, что дефицит цинка, витаминов А и Д снижает функцию натуральных киллеров, а добавление цинка и селена их усиливает [7]. Также, есть данные, что недостаточность цинка, селена и витаминов А, Е приводит к уменьшению количества Т-лимфоцитов, нарушается митоген- и антигениндуцированный синтез ДНК, увеличивается число 0-клеток, снижается соотношение Т-лимфоцитиов/В-лимфоцитов (количество В-лимфоцитов не меняется), происходят другие нарушения в деятельности иммунной системы [4,6].
Выводы. Установлено, что в крови коров в 1-е и 3-и сутки после отела количество Т- и В-лимфоцитов, а также их функциональная активность меньше (р<0,05-0,001), чем за 30 дней до отела. Введение коровам в последний месяц стельности витаминов А, Д3, Е, лизина, метионина отдельно с уксуснокислым цинком или селенитом натрия в форме липосомальной эмульсии приводит к увеличению количества Т-лимфоцитов (общих и теофиллинрезистентных) и В-лим-фоцитов в крови коров, а также у рожденных от них телят, и повышает функциональную активность иммунокомпетентных клеток за счет перераспределения рецепторного аппарата Т- и В-лимфоцитов в сторону увеличения их авидости.
Список летературы
Резюме
В статье приведены данные о влиянии парентерального введения коровам в последний месяц стельности витаминов А, D3, Е, лизина, метионина с уксуснокислым цинком или селенитом натрия в форме липосомальной эмульсии на количество и функциональную активность Т- и В-лимфоцитов крови коров, а также рожденных от них телят. Установлено, что введение коровам указанных исследуемых препаратов активирует клеточные механизмы иммунного ответа в организме стельных коров, а также стимулирует формирование клеточного иммунитета у телят.
Ключевые слова: иммунная система, Т- и В-лимфоциты, витамины A, Д3, Е, микроэлементы, коровы, телята.
Сведения об авторах:
Понкало Леся Игоревна, аспирантка лаборатории иммунологии, Института биологии животных НААН; 79034, Украина, г. Львов, ул. Стуса, д. 38. тел.: +380677530548, ponkalo-lesia@ukr.net.
Ответственный за переписку Вищур Олег Иванович, доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией иммунологии Института биологии животных НААН, д. 38, ул. Стуса, 79034, г. Львов, Украина, тел. +380675988091.
UDC 612.017:577.17:639.111.6
ACTIVITY OF T- AND B-CELL IMMUNITY IN BLOOD OF COWS AND CALVES UNDER INFLUENCE OF NEW IMMUNOTROPIC LIPOSOMAL EMULSION
Ponkalo L.I., Vishchur O.I.
Summary
Results of the research showet that parenteral injection of vitamins A, D3, E, lysine, methionine with zinc acetate or sodium selenite in the form of liposomal emulsion alone, to cows in the last month of pregnancy, lead to the increase of T-lymphocytes (general, theophylline-resistant) and B-lymphocytes' number in the blood of cows and calves, and increasen functional activity of immunocompetent cells due to redistribution of receptive apparatus of T- and B-lymphocytes towards the increase of their avidity.
Key words: immune system, T-and B-lymphocytes, vitamins A, D3, Е, micronutrients, cows, calves.
References:
Author affiliation:
Ponkalo Lesia I., postgraduate student of the laboratory of immunology of the Institute of animal biology of the National Academy of Agricultural Sciences; 38, Stusa st., Lviv, Ukraine, 79034; phone: +380677530548; e-mail: ponkalolesia@ukr.net.
Responsible for correspondence with the editorial board: Vishchur Oleg I., D.Sc. in Veterinary Medicine, senior scientific researcher, chief of the laboratory of Immunology the Institute of animal biology of the National Academy of Agricultural Sciences; 38, Stusa St., Lviv, Ukraine, 79034; phone: +380675988091.
http://vetkuban.com/num3_201215.html