Донник И.М., Петропавловский М.В. Уральский научно-
исследовательский ветеринарный институт, г. Екатеринбург
Введение. В структуре инфекционной патологии сельскохозяйственных животных лейкоз крупного рогатого скота в Российской Федерации занимает лидирующее место и составляет 57% от других нозологии (М.И. Гулюкин, 2003; A.M. Смирнов, 2005).
Широкое распространение этого заболевания в сельскохозяйственных предприятиях и организациях всех форм собственности, социальная значимость данной нозологии, отсутствие средств терапии и специфической профилактики определяют актуальность фундаментальных и приоритетно-прикладных исследований по этой проблеме (П.Н. Смирнов, 1992; В.В. Разумовская, 2004; М.И. Гулюкин, 2003; В.В. Храмцов, М.А. Амироков, 2005 и др.).
Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота является инфекционным заболеванием, вызванным ретровирусом, вирусом лейкоза (ВЛКРС) [1]. У инфицированных животных ВЛКРС внедряется в хромосомную ДНК лимфоцитов в форме провируса в небольшом количестве (1 - 3) копий на диплоидный геном [2]). Так как транскрипция вирусных белков внутри клетки заблокирована, ВЛ КРС остается скрытым, и виремия у зараженных животных не наблюдается [3]. Однако антитела у зараженных животных появляются [4], но не способны устранить вирус, и животные остаются носителями до конца их жизни. Поэтому, диагностика вируса лейкоза обычно основана на обнаружении специфических антител. Однако, недостаточный серологический ответ не эквивалентен недостатку инфекции, и только присутствие провирусной ДНК, внедренной в геном клетки, может служить неоспоримым критерием.(Jacek Kuzmak, Ally Moussa and Jadwiga Grundboeck-Jusko, 1991).
Если изучение этиологических, патогенетических и биологических аспектов (иммунологические, биохимические, цитогенетические) вируса лейкоза крупного рогатого скота достаточно подробно представлены в научных трудах, то гетерогенность вируса лейкоза крупного рогатого скота и его возможное влияние на эпизоотическое и гематологическое проявление лейкоза изучены недостаточно. Более глубокие научные познания в этой области позволят эффективнее проводить оздоровительную работу (Дробот Е. В., 2007)
Установление принадлежности ВЛКРС к определенному генотипу может служить основанием для расширения исследований в данном направлении, в проведении исследований в выявлении патогенетических особенностей развития лейкозного процесса как в экспериментальном, так и в спонтанном вариантах (Дробот Е. В., 2007)
Существующие традиционные методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота - реакция иммунной диффузии (РИД), иммунофер-ментный анализ (ИФА), клинические и патологоанатомические методы, гематологические исследования не обеспечивают полного обнаружения всех инфицированных животных, так как молодняк до 6-ти месячного возраста остается вне плановых исследований в связи с тем, что методы РИД и ИФА практически не пригодны для диагностики лейкоза у телят (С.В.Чичинина и др.,2005; G.Monti et al., 2005).
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на обнаружении генома ретровируса, на два порядка чувствительнее и специфичнее иммунологических методов и имеет хорошую перспективу для диагностики лейкоза, так как позволяет определять наличие генов гликопротеина возбудителя лейкоза у телят с 15-дневного возраста, что крайне важно для изоляции зараженных с раннего возраста животных. По данным М.И. Гулюкина (2005); А.Н. Шарова (2006), известно, что метод ПЦР выявляет до 16% животных, зараженных вирусом лейкоза среди РИД - негативных животных, а число зараженных телят достигает до 11,6%. Кроме того, высокая чувствительность метода ПЦР позволяет использовать его для рекогносцировочных исследований путем определения возбудителя в сборном молоке (В.Н.Сюрин и др., 2000; Kuckleburg et al., 2003).
По принятой системе мероприятий по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота предусматриваются многократные исследования животных в неблагополучных хозяйствах с удалением зараженных животных. В связи с этим выявление зараженных животных в наиболее ранние сроки приобретает особую актуальность, и поэтому применение ПЦР в диагностике лейкоза имеет важное значение, т. к. позволит ускорить сроки оздоровления хозяйств от лейкоза.
Частая повторная встречаемость энзоотического лейкоза в стадах крупного рогатого скота, которые свободны от ВЛКРС в течение многих лет, указывает на то, что ВЛКРС может сохраняться в стаде, не вызывая симптоматических признаков и сероконверсии (появление в сыворотке крови или исчезновение из нее специфических антител) (Лоренц и Straub, 1994)). Это доказывает то, что тот или иной официально предписанный метод обнаружения антител не достаточен, для окончательной оценки оздоровленных от лейкоза стад. Для этого необходимы более углубленные исследования региональных генетических особенностей циркулирующих штаммов ВЛКРС (Fechner и другие., 1997; Elwert, 1997; Mewes, 1997). В последние годы изучены данные последовательностей трех штаммов ВЛКРС провирусов из различных географических областей. Проведено сравнение данных последовательностей, возникающих у штаммов из Бельгии (Rice и другие.,1984, 1985), Японии (Sagata и другие., 1985) и Австралии (Coulston и другие., 1990), при этом выявлено существование различных провирусных вариантов ВЛКРС. Mamoun и другие (1990) сравнили последовательности env генов, кодирующие белок оболочки ВЛКРС gp5l и gp30, семи штаммов из Японии, Северной Америки и Европы и классифицировали их в европейской и североамериканской-японской подгруппе. Для изучения корреляции клинически бессимптомного постоянства ВЛКРС с известным провирусным генотипом, исследуют штаммы различного происхождения в ПЦР, с последующим RFLP- методом (restriction fragment length polymorphism - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), который заключается в обработке ДНК, выделенной из заведомо подлинного образца сырья (стандарта), ферментом рестриктазой. Полученные фрагменты разделяют в агарозном геле путем электрофореза, и затем переносят на нитроцеллюлозную мембрану. А также ДНК секвенированием.
Генотипическое разнообразие ВЛКРС и результаты сравнительного исследования, в контексте их эпизоотической значимости в неблагополучных по лейкозу стадах, открывают новые методические подходы в разработке научно-обоснованных схем оздоровления неблагополучных по лейкозу стад.
Цель работы. Изучить особенности молекулярно-генетической структуры вируса лейкоза крупного рогатого скота, чтобы достигнуть лучшего понимания молекулярной эпидемиологии ВЛКРС - инфекций. (Dagmar Beier, Petra Blankenstein, O. Marquardt, J. Kuzmak).
Материалы и методы. Исследования проведены на базе УрНИ-ВИ и Польского национального исследовательского ветеринарного института, согласно договору о научном сотрудничестве.
Исследованию подвергнуты пробы лейкоконцентрата от телят возрастом от 3,5 до 4 месяцев и гематологически больной коровы 6 летнего возраста.
Лейкоконцентрат периферической крови был подготовлен от двукратно серологически положительных животных (РИД) из крови, предварительно стабилизированной версеном-2, методом центрифугирования (3500 об. сек.) и последующим гемолизированием эритроцитов осмотическим шоком (применение дистиллированной воды 3-4°С, и 4,5% NaCl). Осадок отмывали в фосфатном буферном растворе (PbS) 3-х кратно при последовательном центрифугировании 2600 оборотов в секунду. Для дальнейшего извлечения геномной ДНК осадок замораживали. Геномную ДНК очищали при помощи комплекта Dneasy (QIAGEN) и концентрацию ее оценивали спектрофотометрией. Для ПЦР приблизительно использовались 20 мкл. Амплификацию проводили согласно методам описанным Beier и др. (2001). При помощи электрофореза на 2%-ом геле после окрашивания этидия бромидом был проанализирован продукт амплификации 444 bp, фрагменты 3-х окончаний env гена.
Эта ДНК была непосредственно подвергнута "вложенной" ПЦР, которая увеличивает env ген между нуклеотидами 5099 и 5542 (Beier, 1998). Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР разрабатывались согласно данным последовательности, изданным Sagata и другими (1985). Праймеры, соответствующие env гену были выбраны потому, что эта область распространена среди различных штаммов ВЛКРС провирусов (Rice и другие., 1984; Sagata и другие., 1985; Mamoun и другие., 1990).
Как следствие, мы использовали следующие праймеры:
env5032 5'-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA-3' и
env5099 5' -CCCACAAG GGCGGCGCCG GTTT-3',
обратные праймеры были
env5521r 5 '-GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG-3' и
env5608r 5'-ААCААCААCCТCТGGGАAGGGТ-3', соответственно.
Набор env5099 и env5521r установлен и описан Naif и другие. (1990, 1992) и Brandon и другие. (1991).
Все праймеры, используемые в этом опыте были получены от MWG Биотехнологии (Ebersberg, Германия).
Смесь для реакции ПЦР была приготовлена и распределена по 50 мкл. Состав смеси: 5 мкл 10 х ПЦР буфера (500 мМ KC1, 100 мМ Трис-HCI [pH 9.0], 1%-ый Тритон X-I00; Promega, Мадисон, США), 1,5 мМ MgCl2, 75микроМ каждый деоксинуклеотид трифосфат (dNTP) (Roche, Boehringer Mannheim, Германия), по 0.2 микро М каждого праймера, 1.25 единицы Taq полимеразы (Promega, Германия) и ДНК как описано выше.
env - "вложенная" ПЦР была выполнена с парой праймеров env5032 и env5608r (внешние праймеры, заканчивающиеся амплификацией 600bp фрагментов) и env5099 и env5521r (внутренние пра-имеры).
Реакция амплификации выполнялась в ДНК термальном цикле-ре 480 (Perkin-Elmcr Cetus, Inc, Wcitcrsladt, Германия) или Трио-термоблоке (Biomctra, Giittingen, Германия). Сначала, провели начальную инкубацию в 94 °C в течение 2 минут, затем следовало 40 амплифи-кационных циклов, состоящих из денатурации при температуре 95 °C 30 секунд; сборка праймеров при температуре 62 °C (для пары прай-меров env5032 и env5608r) и 70 °C (для пары праймеров env5099 и env5521r) 30 секунд; сборка праймеров при 72°C в течение 60-ти секунд, за которыми следует финальный шаг - 72 °C 4 мин. Для следующего этапа были взяты три микролитра ПЦР продуктов, как для первой амплификации, так и реамплификации. Чтобы визуализировать ПЦР результат, 15 микролитров амплифицированной смеси помещали на 1,5 % гель агарозы, и далее окрашивали этидия бромидом.
Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLPA)
Направленное расщепление 10 мкл env - ПЦР продуктов с 5 U BclI, PvuII и BamHl (Boehringer Мангейм, Германия) использовалось, чтобы проверить специфичность ампликонов и определить подгруппу ВЛКРС
ДНК -секвенирование
ПЦР фрагменты были отделены от праймеров и нуклеотидов, при помощи QIAquick колонн (Qiagen, Hilden, Германия). Последовательности выделенных ПЦР продуктов определяли при помощи набора флуоресцентного, окрашивающего деокситерминирующего цикла для секвенации (Perkin-Elmer Cetus, Inc, Weiterstadt, Германия) и проанализировано при помощи ABI Prism 377 ДНК секвенатора (Applied Biosystetns, Weiterstadt, Германия).
Было установлено филогенетическое дерево, используя пакет программ DNASIS для Windows 1.1.(Hitachi, Япония), расшифровка и описание которого в настоящее время проводится
Выводы
Список литературы
Реферат. От больного лейкозом крупного рогатого скота (корова, телята) среднего Урала России исследован лейкоконцентрат крови. Выделен возбудитель лейкоза. Впервые в Уральском регионе изучена молекулярно-генетическая структура возбудителя лейкоза, циркулирующего в популяции крупного рогатого скота оздоравливаемых стад. Вирус по молекулярно-генетической структуре отнесен к американскому типу А.
Ключевые слова: вирус лейкоза крупного рогатого скота, лейкоконцентрат, молекулярно-генетическая структура, популяция крупного рогатого скота оздоравливаемого стада, американский тип А.
Summary.
The peripheral blood of the leukocytes of the BLV cattle in middle Urals of Russia was investigated. The agent of BLV was separated. For the first time in the Urals region the molecular - genetic structure of causal agent of BLV cattle circulating in the population of the sanited herds was studied. The virus of molecular-genetic structure belonged to American type A.
Key words: Bovine leukemia virus, peripheral blood leukocytes, molecular - genetic structure, population of the sanited herds, American type A.
Сведения об авторах:
М.В. Петропавловский, науч. сотрудник отдела мониторинга и прогнозирования инфекционных болезней УрНИВИ
Ответственный за переписку с редакцией И.М. Донник, академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор, директор Уральского научно-исследовательского института. Адрес: 620142, г. Екатеринбург, ул. Белинского 112 а. тел.: /343/ 257-20-44, 257-78-71, 257-79-71. Факс: /343/ 257-3275, 257-82-63 Эл. Почта: info@urnivi.ru
http://vetkuban.com/num3_20105.html