Интерпретация результатов ELISA для вируса инфекционного бронхита (IBV)

Dr. Bart van Leerdam n BioChek B.V. ,
Burg. Bracklaan 57, 2811 BP Reeuwijk , Netherlands
Dr Pieter Kuhne n Intervet/ Schering Plough Animal Health,
P.O. Box 31 5830 AA Boxmeer, Netherlands

Использование данных серологии, полученных с помощью ме­тода ELISA, в системе организации здоровья птицы было повсемест­но принято для многих заболеваний, включая инфекционный бронхит (IBV). Серология является полезным инструментом для отслеживания иммунного ответа после вакцинации и для постановки диагноза. Очень трудно найти в литературе практические рекомендации касательно ин­терпретации результатов (IBV) ELISA.

Часто остаются без ответа такие практические вопросы, как: "Какой уровень титров и какой коэффици­ент вариации (CV) следует ожидать после вакцинации против IBV?" и "Можно ли провести различие между вакцинацией и полевым зараже­нием с помощью IBV ELISA?". В данной статье освещается применение и интерпретация результатов анализа IBV ELISA после вакцинации жи­вой и инактивированной вакцинами, и как серология может облегчить идентификацию заражения вирусом инфекционного бронхита в полевых условиях. Где это представляется возможным, обсуждаются сероло­гические результаты полевых историй болезни Обоснование мониторинга IBV

Связанные с заболеванием проблемы иногда возникают даже у вакцинированных птиц. Связано ли это с качеством вакцины? Возмож­но, но гораздо чаще, неудача вакцины является следствием неудовлет­ворительного обращения и/или применения вакцины. Поэтому, когда имеешь дело с вакцинацией живой вакциной против респираторных заболеваний, наподобие IBV, важно оценить успешность вакцинации Это связано с тем, что успешная вакцинация не всегда является не­избежной, поскольку трудно обеспечить доставку эффективной дозы всем птицам без исключения при использовании методов массовой вакцинация (например, с питьевой водой и спрей методом) для живых вакцин IBV

Мониторинг иммунного ответа на вакцинацию помогает обнару­жить и диагностировать какие-либо сбои с тем, чтобы предпринять кор­ректирующие меры, если вакцинация оказалась неудачной. Таким об­разом, отслеживание результатов вакцинации следует рассматривать как "Контроль Качества" вакцинаций, проводимых в полевых условиях Это приводит нас к очень важному моменту при мониторинге с помо­щью ELISA: следует быть готовым предпринять должные меры в зави­симости от результатов. Без принятия мер нельзя ожидать улучшения оптимизации и поддержания эффективности программ вакцинации

Интерпретация результатов ELISA

Для того чтобы успешно интерпретировать результаты ELISA пос­ле серологического мониторинга вакцинированных стад, должны быть соблюдены следующие условия.

Фото 1
Фото 1
Фото 2
Фото 2
Фото 3
Фото 3

В лаборатории следует использовать внешние референтные контроли, чтобы иметь дополнительную гарантию воспроизводимости и точности результатов и обеспечить правильную интерпретацию. Без референтных контролей, в случае получения аномальных титров, мы незнаем, либо это результат ошибок при проведении процедуры теста либо это фактическое отражение иммунного статуса птиц в полевых условиях.Перед проведением анализа необходимо иметь представление о том, какой результат является ожидаемым (базисный уровень титров для успешной вакцинации). Это позволит легче интерпретировать ре­зультаты, сравнивая с базисным уровнем, и легко судить об успешности вашей программы вакцинации. Также необходимо иметь представле­ние о том, какие действия следует предпринять, если результаты не со­ответствуют ожидаемым

На практике интерпретация результатов вакцинации обычно про­водится путем оценки трех основных компонентов гуморального ответа после введения вакцины, которыми являются

Интенсивность отклика, на что указывает значение среднего титра. Развиваются ли у птиц уровни титров в ожидаемом диапазоне (базисный уровень) для примененной вакцины? Эти титры базисно­го уровня могут варьировать в зависимости от типа птицы, возраста типа вакцины, программа вакцинации и т.д. В каждом конкретном случае следует разработать собственные базисные уровни для своих программ вакцинации и условий на месте. Пример базисных уровней при вакцинации бройлеров против IBV приводятся в таблицах 1 и 2 (в конце статьи). Можно видеть, что базисные уровни (средний титр) могут варьировать в зависимости от использованных вакцинных штаммов Применение относительно мягких вакцин Н120 будет давать значитель­но меньшие титры по сравнению с ответом, полученным после приме­нения более иммуногенных вакцинных штаммов, таких как IB 4/91

Однородность отклика, на что указывает %CV (коэффициент вариации). Была ли вакцина доставлена каждой птице или нет? Нахо­дится ли %CV в пределах требуемого диапазона, или есть ли возмож­ность для улучшения?

В качестве общего руководства для коэффициента вариации пос­ле вакцинации можно привести следующие значения:

Хотя эти общие рекомендации применимы для большинства жи­вых и инактивированных вакцин, следует иметь в виду, что использо­вание живых вакцин против респираторных заболеваний наподобие IBV, генерирует в целом неоднородный отклик в титрах. Горизонтальное распространение вакцинного вируса среди стад может быть ограничен­ным, а, кроме этого, живые IBV вакцины могут также давать местный иммунный отклик, который нельзя измерить с помощью метода ELISA Поэтому в случае применения таких живых вакцин, как вакцина Н120 ожидаемый СУдля хорошей вакцинации будет составлять 40-70%. Зна­чение CV на уровне <30% после вакцинации вакциной Н120 следует рассматривать, как подозрение заражения. Однако, при использова­нии в программе вакцинации более иммуногенных вакцин, наподобие штамма 4/91, значения CV ниже 45% не являются редкими.

В случае племенного поголовья или кур-несушек, где перед ина-ктивированной вакциной применяется целый ряд вакцинаций с по­мощью живых вакцин, полная сероконверсия (100% птиц позитивны) является более важным критерием успеха, чем только один показатель %CV. Было продемонстрировано, что хорошее праймирование живыми вакцинами перед инактивированной оказывает сильное и благоприят­ное влияние на величину и стойкость титров в течение всего периода продуктивности. Следует проверить, являются ли все птицы (100%) се-ропозитивными

Продолжительность отклика, на что указывает средний титр в зависимости от времени. Достаточно ли долго сохраняются титры во времени? Необходима ли еще одна вакцинация с целью форсиро­вания подъема титров выше минимальных защитных уровней или для добавления местной защиты?

Как уже упоминалось, существует четкая связь между титрами полученными после живых вакцин и стабильностью титров в ходе про­дуктивного периода племенного поголовья и кур-несушек после вакци­нации инактивированной вакциной. Хорошее праймирование (положи­тельные и однородные титры) перед применением инактивированной вакцины приведет к более стабильным и высоким титрам в течение продуктивного периода. И, наоборот, слабые титры после праймирова-ния (низкие, неоднородные титры с высоким процентом отрицательных результатов) приведут к высоким титрам в начале периода продуктив­ности и к низким титрам в середине и конце периода яйцекладки. В целом, титры IBV имеют тенденцию к меньшей стабильности в течение периода продуктивности по сравнению с титрами к болезни Гамборо и болезни Ньюкасла. Действительная причина такой нестабильность остается неизвестной, однако она лишь подчеркивает необходимость отслеживания титров IBV в критических точках с целью определения того, не следует ли провести дополнительную вакцинацию с целью сти­муляции подъема снижающихся титров.

Еще одним фактором, определяющим успех инактивированной вакцины, является уровень антител в момент введения. Высокие титры антител в момент применения могут помешать серологическому откли­ку на инактивированную вакцину. Такая ситуация, в частности, была замечена после применения более иммуногенных вакцин, наподобие 4/91, незадолго до вакцинации инактивированной вакциной кур-несу­шек и племенного поголовья. Примером такой программы может быть ситуация, когда племенное поголовье вакцинируют в период выращи­вания с применением стандартных живых вакцин типа Н120 и МА5 после чего следует вакцинация с помощью IBV4/91 в возрасте 10-15 недель и, наконец, вакцинация инактивированной вакциной против BV в возрасте 18 недель. При применении такой программы часто отмечается снижение титров антител при тестировании образцов сы­воротки в возрасте 24 недели, а не подъем титров, как это имеет место в случае применения программы вакцинации без вакцины 4/91. При использовании диагностических наборов системы BioChek результаты могут быть следующими:

Средний титр ELISA в возрасте 24 недели

Программа с 4/91 - незадолго до инактивированной вакцины 2000 - 5000
Программа с 4/91 - за 8 недель до инактивированной вакцины: 6000-16000

По всей видимости, этот эффект можно преодолеть, обеспечивая достаточный интервал между вакцинацией 4/91 и применением ина­ктивированной вакцины. Рекомендуемый интервал должен быть не менее 4-8 недель

Успех или неудача вакцинации

Индикаторами успешной вакцинации обычно являются высокие однородные и длительно сохраняющиеся титры, находящиеся в ожида­емом диапазоне для данного типа вакцины. Эти образцы должны быть 100% позитивными

Индикаторы плохого результата вакцинации в целом являются противоположными: т.е., титры ниже ожидаемых, неоднородные и не­долговременные. Титры "ниже базисного уровня" обычно сопровожда­ются некоторым количеством отрицательных результатов - отумеренной до высокой степени. Мониторинг IBV с определенными интервалами у кур-несушек и племенного поголовья особенно полезен для раннего выявления неудачной вакцинации. Немедленная ревакцинация сразу после выявления неудачной вакцинации будет способствовать предо­твращению потерь продуктивности в будущем. Таким образом, отсле­живание результатов вакцинации имеет профилактическую природу что является важным в плане экономического обоснования примене­ния программ мониторинга

В случае проявления полевого заражения IBV, мониторинг также будет способствовать обеспечению ранней диагностики заболевания с целью ограничения причин потерь продуктивности. Ниже обсуждается как мониторинг может помочь в диагностике полевого заражения IBV

Диагностика полевого заражения IBV.

Диагноз можно поставить комбинированной оценкой истории стада, клинических признаков, серологии, а также изоляции и иденти­фикации патогена. Серологический мониторинг в особенности полезен для установления времени появления и характера полевой инфекции

Для невакцинированных стад присутствие полевого заражения BV может быть легко продемонстрировано положительной серологией IBV. Однако для IBV вакцинированных стад идентификация полевого заражения затруднительна и требует знания ожидаемых титров после вакцинации (базисный уровень). Каждый пользователь системы ELISA должен разработать свои собственные базисные уровни титров в за­висимости от: программы вакцинации, специфики используемых вак­цин и вида птиц. Эти данные в сочетании с периодическим анализом серологического профиля стад, т.е. серологической истории, позволяют определить являются ли серологические результаты нормальными или аномальными. Неожиданный подъем титров, значительно превышаю­щий ожидаемые титры после вакцинации, могут указывать на присутс­твие полевого заражения. Однако следует подчеркнуть, что титры сами по себе не могут использоваться для постановки диагноза. Диагностику следует проводить на основе комплексной оценки результатов сероло­гии, клинической симптоматики, а также изоляции патогена. До тех пор пока не будет поставлен диагноз, рекомендуется использовать понятие "подозрение на инфекцию", вместо термина "инфекционные титры"

Идентификация IBV инфекции

В случае аномально высоких IBV титров следует учитывать три ключевых критерия, которые должны выполняться для того, чтобы сде­лать вывод, что полученная серология - результат заражения IBV:

Средний титр после инфекции должен быть значительно по­вышен. Обычным правилом является, что средний титр после инфек­ции, должен, по меньшей мере, в два раза превышать уровень, кото­рый является ожидаемым после вакцинации, или должен хотя бы в два раза превышать средний уровень титров до инфекции

Значения CV должны быть значение снижены. Коэффициент вариации (CV) должен быть значительно ниже уровней, которые явля­ются ожидаемыми после вакцинации, или значительно ниже уровней CV до инфекции. Например, если Вы вакцинируете цыплят-бройлеров дважды с помощью вакцины Н120, ожидаемый CV находится в диапа­зоне 50- 80 %. Если после вакцинации Вы получаете значение CV на уровне 35%, то это является указанием на аномальный отклик

Клинические признаки должны соответствовать серологии Если серология IBV повышена, но клинические признаки отсутствую или не согласуются с инфекцией IBV, то Вы просто не сможете подтвер­дить инфекцию IBV

Приведенные ниже цифры указывают на серологию полевых случаев IBV инфекции у племенного поголовья и цыплят-бройлеров и помогают проиллюстрировать упомянутые выше ключевые критерии В обоих из этих случаев применяют 3 ключевых критерия

Пример 1. Серология IBV племенного поголовья до (34 недель) и после инфекции (37 недель). Серология после инфекции указывает на значительно повышенный средний титр и сниженный коэффициент вариации (CV) по сравнению с серологией до инфекции. Клинические признаки согласуются и соответствуют IBV серологии после инфекции

Родители бройлеров в 35 недель 15% снижение яйценоскости

До инфекции. 34 нед.
До инфекции. 34 нед.
После инфекции. 37 нед
После инфекции. 37 нед

Клинические признаки: мелкие, деформированные яйца и снижение яйценоскости на 15 %

Соответствующее повышение тигров и снижение %CV

Пример 2. Серология бройлеров в возрасте 44 дня, после двук­ратной вакцинации Н120. Средний титр значительно увеличен, коэф­фициент вариации (CV) значительно снижен. Клинические симптомы также соответствуют серологической картине

Осложненные IBV инфекции

Несмотря на то, что в случае проявления респираторных призна­ков можно подозревать инфекцию IBV, рекомендуется также провести тестирование инфицированных птиц на предмет присутствия других респираторных патогенов по двум причинам

Инфекции IBV часто происходят в сочетании с другими респи­раторными патогенами, в частности, вирусом птичьего ринотрахеита (ART) (известен также, как птичий пневмовирус (APV)), Ornithobactenum rhinotracheale (OR), Mycoplasma gallisepticum (MG) и Mycoplasma synoviae (MS). Осложненные инфекции можно диагностировать лишь путем просмотра всей серологической картины. Тестирование только на IBV не укажет на взаимодействующие патогены респираторной бо­лезни

Серология после респираторных вакцин типа IBV и NDV часто аномально искажается из-за повреждений, присутствующих после респираторного заражения (трахеит и/или аэросаккулит). Эти повреж­дения делают возможным более активный контакт и проникновение вакцинного вируса в рецепторных местах, что приводит в результате к повышенной по сравнению с нормой серологии после применения живых вакцин IBV и NDV. Это является одной из причин частой ложной диагностики инфекции пневмовирусами (ART), как инфекции IBV, если оценивать только серологию IBV. Анализ всей серологической картины позволяет увидеть характер взаимодействия с другими респираторны­ми агентами, что позволяет надлежащим образом поставить диагноз осложненной инфекции. Часто принятие во внимание ключевых кри­териев при определении инфекции (как описано выше) помогает ис­ключить "эффект пораженной трахеи": как правило усиленные реакции на вакцину не приводят к удвоению ожидаемых средних титров и/или значительному снижению коэффициента вариации (%CV).

Приведенные ниже две истории болезни демонстрируют полез­ность проведения полного тестирования птиц с респираторными забо­леваниями

История болезни 1:

Хроническая респираторная инфекция, ложно диагностиро­ванная, как инфекционный бронхит (IBV)

Стадо бройлеров было дважды вакцинированно живой IBV вак­циной МА5

В возрасте 21 день у птиц обнаруживалась тяжелая респиратор­ная клиника в сочетании с распухшей головой и смертностью на уров­не 10-15%. Вскрытие выявило аэросаккулит с желтым пенистым экссу­датом, который был отнесен на счет инфекции Е. coli.

Рутинная серология на инфекционный бронхите помощью ELISA выявила слегка повышенные средние титры с более однородным от­кликом, чем обычно. В связи с тем, что титры были повышены, был сде­лан вывод о том, что цыплята-бройлеры были заражены инфекционным бронхитом с вторичной инфекцией Е. coli. В программу вакцинации бройлеров была введена третья вакцинация против IBV, но респиратор­ные признаки сохранились. Если провести более полное серологичес­кое обследование, то обнаруживаются значительные положительные титры ART и OR.

История болезни 2:

Осложненная инфекция IBV с нефропатогенным вариант­ным штаммом.

Стадо бройлеров было дважды вакцинированно живой вакциной Massachusetts (Н120) в возрасте 1 и 20 дней. Птиц также дважды вак­цинировали от NDV с применением живой вакцины Avinew в возрасте 1 (спрей) и 20 дней (выпаивание с водой). В возрасте 14-21 дней у птиц проявились респираторные признаки, мягкая диарея и смертность Посмертное обследование выявило трахеит и нефрит. У некоторых птиц аэросаккулит с плотным желтоватым пенистым экссудатом. На приве­денных ниже фотографиях иллюстрируется ситуация на ферме. Пока­заны тяжелый трахеит, воспаление почек (нефрит) и аэросаккулит с плотным творожистым экссудатом.

Ниже приводятся полученные с помощью ELISA данные сероло­гии у цыплят в возрасте 46 дней. Тесты на MG и MS оказались отри­цательными (данные не показаны). Серология IBV выявила аномально высокие титры со значением CV (25%), что значительно ниже ожидае­мого диапазона (50 - 100%). Клинические симптомы также согласовы­вались с повышенными титрами IBV

Результаты серологии ART и OR были также положительными, ука­зывая на наличие этих попутных инфекций, поскольку птицы не подвер­гались вакцинации. Серология на предмет NDV показала повышенные по сравнению с нормой титры, но усиленная реакция, по всей види­мости, была связана с "эффектом поражения трахеи" вакцинным виру­сом. Для NDV также не удовлетворялись ключевые критерии, которые указывают на инфекцию. (Средний титр в два раза ниже ожидаемого после вакцинации). На основе этих результатов можно сделать вывод о том, что птицы первоначально были инфицированы нефропатогенным штаммом инфекционного бронхита, a ART и OR действовали в качестве вторичных патогенов

Был разработан план на случай непредвиденных дополнительных обстоятельств, который включал вакцинацию с применением живого вариантного штамма IBV (4/91) в возрасте 14 дней с питьевой во­дой. После реализации новой программы параметры продуктивности вернулись к норме. Образцы сыворотки от пораженных стад, исполь­зованных для тестирования с помощью ELISA, были отправлены в ла­бораторию компании Intervet в Боксмеере, Голландия, для проведения серотипирования с помощью теста нейтрализации вируса (VN). Резуль­таты обобщены в приведенной ниже таблице:

История болезни 3:

Серотипирование инфекции IBV с QX-подобным штаммом у бройлеров с респираторной инфекцией

Цыплят-бройлеров вакцинировали дважды вакциной Н120 в воз­расте 1 и 20 дней

В возрасте 14-21 дней у птиц были обнаружены респираторные признаки, нефрит и увеличение смертности

Результаты серологии цыплят в возрасте 46 дней

Специфический тест нейтрализации вируса (VN) выявил самый высокий титр для QX-подобного (или D388) штамма у птиц, которые были вакцинированы только вакциной Н120 серотип Massachusetts (в тесте VN определяется с М41). Можно сделать вывод о том, что результа­ты серологии с помощью метода ELISA оказались очень полезными для ранней диагностики природы первичного патогена (нефропатогенный IBV) и помогли предотвратить дальнейший урон путем немедленной корректировки программы вакцинации, которая включала вакцину с вариантным штаммом IB 4/91

Дополнительное серотипирование с помощью теста нейтрали­зации вируса (VN) помогло установить конечный диагноз до уровня специфического штамма (тип D338). Оно подтвердило обоснованность использования вариантного штамма в программе вакцинации с целью расширения спектра защиты против различных вариантов инфекцион­ного бронхита. Осведомленность о присутствии этого серотипа на пти­цеферме может также оказаться полезной в разработке эффективных программ вакцинации для других пораженных ферм в данном регио­не

Заключение

Основное преимущество серологического мониторинга инфекци­онного бронхита с помощью ELISA заключается в следующем:

Ключевым пунктом применения программы мониторинга явля­ется то, что в зависимости от полученных результатов следуют опреде­ленные действия. Принятие немедленных соответствующих мер явля­ется очень важным для ограничения и предотвращения дальнейших экономических потерь. Если результаты вакцинации являются неудов­летворительными, это позволит провести повторную оценку процедур вакцинации против IBV и осуществить корректирующие действия. Это делает регулярный мониторинг экономически эффективным профилак­тическим средством. Повышение эффективности применения вакцины приведете результате к более эффективному контролю над заболевани­ем и повышению продуктивности стад

Резюме

Данная статья с практической точки зрения иллюстрирует ключе­вые моменты в интерпретации результатов серологии с помощью ELISA после вакцинации живыми и инактивированными вакцинами против инфекционного бронхита, а также идентификации заражения IBV. По возможности, результаты серологии обсуждаются на примерах истории болезни в полевых условиях. Особое внимание уделяется следующим ключевым моментам:


http://vetkuban.com/num3_20094.html