Непоклонов А.Л. ГАНО"Научно-исследовательский институт
диагностики и профилактики болезней человека и животных"
Маврин Н.А. ООО "Ветбиохим"
Костина Л.В., Козлов А.Ю. "ФГБУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского"
Прохорова И.А. ООО "ВЕТТрейдинг"
Гипс-дерматоз - паразитарное заболевание крупно о рогатого скота, вызываемое личинками подкожного овода H.lineatuin V и H.bovis. На территории Российской Федерации широко распространены оба вида подкожных оводов. Ущерб, причиняемый личинками овода, складывается из потерь молока и мяса, порчи кожевенного сырья. По данным В.К. Метелицы (1983) потери при гиподерматозе крупного рогатого скота складываются из снижения на 8% прироста массы тела молодняка, на 9% (200 л молока в год на корову) молочной продуктивности и снижения на 50-55% качества шкур. Личинки подкожного овода, паразитируя в организме крупного рогатого скота, наносят непоправимый ущерб его здоровью, повреждая внутренние органы и ткани, кожный покров. Личинки I стадии овода выделяют три основных фермента - гиподермины А (НА), В (НВ) и С (НС), которые играют важную роль в жизнедеятельности паразита (1). Гиподермины А и В эффективно разрушают иммуноглобулины крупного рогатого скота, понижая их биологическую активность, снижают пролиферацию лейкоцитов (2). Гиподермин С обладает гистологической и дермолитической активностью, способствуя передвижению паразита внутри организма животного (3). Кроме того, выделяемые личинками оводов ферменты могут оказывать крайне негативное воздействие на организм хозяина в целом. Установлено, что при введении содержимого личинок I стадии подкожного овода в организм кролика, у подопытного животного наблюдается резкое снижение свёртываемости крови, повышение артериального давления, изменения в зародышевых клетках.
Материалы и методы
Очищенный гиподермин С получали путём очистки личиночного гомогената с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-сефа-розе (5). Степень чистоты и подлинность полученного гиподермина С устанавливали SDS-электрофорезом в 12% полиакриламидном геле, а специфичность - в непрямом иммуноферментном анализе с сыворотками крови крупного рогатого скота, содержащими и не содержащими антитела кгиподермину С.
Сыворотки крови крупного рогатого скота получали из хозяйств Смоленской и Брянской областей в октябре-ноябре месяце. Сыворотки хранили при -200С.
Положительные и отрицательные сыворотки крови крупного рогатого скота на содержание в них антител к возбудителю гиподерматоза определяли с помощью коммерческого набора "Гиподерма-серотест. (АНО НИИДПБ, г. Москва).
Моноклональные антитела получали путём иммунизации мышей линии BALB/c очищенным гиподермином С. Гибридизацию проводили по методу Kohler, Milstain, 1976 г. Культуральные жидкости тестировали на наличие антител к гиподермину С в иммуноферментном анализе. Клоны, обнаруживающие специфическую активность, реклонировали методом лимитирующих разведений. Позитивные реклонированные гибридомы наращивали в культуральных флаконах, увеличивая обьём (Greiner, Германия). Асцитные жидкости, содержащие моноклональные антитела, получали после введения гибридомных клеток в брюшную полость праймированных мышей линии BALB/c. Очистку моноклональных антител из асцитной жидкости осуществляли путём осаждения белков при помощи каприловой кислоты (Sigma, США). Определение субкласса моноклональных антител, синтезируемых гибридомными клеточными линиями, проводили методом иммуноферментного анализа с помощьюнабора "Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit" (Sigma, США).
Поликлональные антитела к гиподермину С получали путём 2-х стадийной иммунизации кролика очищенным продуктом. Из полученной гипериммунной сыворотки выделяли глобулиновую фракцию путём осаждения её сульфатом аммония. Очистку поликлональных антител проводили на полиакриламидном иммуносорбенте, содержащем в качестве лиганда очищеный гиподермин С.
Приготовление коньюгата (поликлональные антитела меченые пероксидазой хрена) проводили по методу P.K.Nakane и A.Kawaoi (1974 г.).
Результаты исследований
Задачей первого этапа исследований являлось получение очищенного гиподермина С из лизата личинок I стадии подкожного овода. На рисунке 1 представлена картина SDS-электрофореза очищенного гиподермина С и личиночного лизата в 12% полиакриламидном геле. На рисунке показано, что гомогенат личинки 1-й стадии подкожного овода (дорожка 2) содержит три белка - гиподермин А, В и С. а на дорожке 3 - только очищенный гиподермин С молекулярной массой 23- 24 кДа.
Рис.1. ДСН-ПААГ электрофорез: 1 - маркеры молекулярного веса; 2 - лизат личинки I стадии подкожного овода; 3 - очищенный гиподермин С.
Полученный продукт специфично взаимодействовал с положительными и не взаимодействовал с отрицательными сыворотками крови крупного рогатого скота (рис.2).
Рис.2. Взаимодействие положительной и отрицательной на гиподерматоз сывороток крови крупного рогатого скота с гиподермином С, полученным при его очистке ионообменной хроматографией.
Очищенный гиподермин С использовали для иммунизации мышей с целью получения моноклональных антител. В результате работы было получено 4 гибридомы. стабильно продуцирующие моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с гиподермином С. Изотипирование полученных моноклональных антител показало что все они относились к субизотипу IgGl. Изучение возможности использования полученных моноклональных антител в "Сэндвич"-ИФА показало что они могут использовать только как "детектирующие" или только как "сенсибилизирующие" антитела таккакоба моноклональных антитела получены к одному эпитопу антигена. Поэтому следующим этапом нашей работы было получение поликлональных антител, направленных к разным эпи-топам гиподермина С. Полученные поликлональные антитела проверили в непрямом иммуноферментном анализе где они показали высокую активность и специфичность к гиподермину С (рис 3)
Рис.3. Определение иммунноактивности поликлональных антител к гиподермину С.
Моно- и поликлональные антитела против гиподермина С были проверены в разных комбинациях в "СЭндвич"-ИФА для определения гиподермина С в сыворотке крови крупного рогатого скота. Наибольшей чувствительности удалось добиться с использованием сорбированных в лунках иммунологического планшета моноклональных антител и аффинно-очищенных поликлональных антител в качестве ¦детектирующего" элемента.
На иммунологический планшет сорбировали очищенные моноклональные антитела n1g10 в количестве 1.5 мкг/мл в течение 12 часов при +40С После стадий отмывки и блокирования мест неспецифического связывания в лунки планшета вносили по 100 мкл исследуемых проб сывороток крови без разведения и стандарты. Инкубировали в течение 60 минут при +370С. Затем, после отмывки, в каждую лунку плашки добавляли по 100 мкл коньюгата (поликлональные антитела меченые пероксидазой хрена) в разведении 1/2000 и инкубировали в течение часа при +370С. Снова отмывали плашку и в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора перекиси водорода с тетраметилбензидином Реакцию останавливали через 15 минут путём добавления 1М водного раствора серной кислоты в лунки плашки
На рисунке 4 представлена калибровочная кривая количественного определения гиподермина С в "Сэндвич"-ИФА в сыворотке крови крупного рогатого скота не содержащей антитела к антигену подкожного овода. Очевидно, что разработанная тест-система позволяет выявлять гиподермин С в диапазоне концентраций 15 - 20 нг/мл и выше в испытуемой пробе.
Рис.4. Калибровочная кривая определения гиподермина С в отрицательной сыворотке, не содержащей антитела к возбудителю гиподерматоза крупного рогатого скота.
В лаборатории были проведены полевые испытания разработанной тест-системы с использованием сывороток крови крупного рогатого скота Всего было проверено около 300 проб сывороток крови на содержание в них гиподермина С. из которых только 2 сыворотки дали положительный результат В положительных пробах было обнаружено 175 нг/мл и 250 нг/мл гиподермина С соответственно В тоже время, проведённые ранее исследования этих же проб сывороток крови на наличие в них антител к возбудителю гиподерматоза показали их наличие в 19 положительных образцах что говорит о вероятности нахождения личинок паразита в организме животного. Гиподермин С. выделяемый личинками подкожного овода, был обнаружен только в двух случаях. В первом - сыворотка не имела антитела к возбудителю гиподерматоза. а во втором - в сыворотке антитела присутствовали. Такие результаты можно объяснить тем. что в сыворотках крови которые содержат антитела к возбудителю гиподерматоза крупного рогатого скота, гиподермин С может не определяться из-за циркуляции в них иммунных комплексов антиген-антитело Это можно объяснить защитной реакцией организма животного, иммунная система которого инактивирует и разрушает опасный антиген Однако, в некоторых сыворотках не смотря на наличие антител, гиподермин С выявляется, что по-видимому зависит от состояния иммунной системы отдельного животного от количества паразитирующих личинок внутри животного и. возможно, от неравномерного выделения паразитом гиподермина С в организм крупного рогатого скота что требует проведения дополнительных исследований. Тем не менее, обнаружение гиподермина С в обоих случаях с помощью разработанной тест-системы свидетельствует о нахождении личиночного фермента (гиподерматоксина) в организме крупного рогатого скота, а в последствии соответственно, и в продукции животноводства (молоко мясо).
Список литературы
Реферат
Разработана диагностическая тест-система на основе "Сэндвич"-ИФА для обнаружения фермента личинки I стадии подкожного овода в сыворотке крови КРС Получены специфические компоненты тест-системы: очищенный антиген (гиподермин С) моноклональные антитела мыши и поликлональные антитела кролика специфичные к гиподермину С. Оптимизированы условия проведения тест-системы для выявления гиподермина С в биологической пробе. Установлен предел чувствительности обнаружения антигена личинки в .сэндвич"-ИФА Минимальное количество детектируемого гиподермина С в сыворотках крови КРС составляет 15-20 нг/мл Однако предел обнаружения гиподермина С в сыворотках крови животных содержащих антитела к возбудителю гиподерматоза КРС значительно меньше
Ключевые слова: подкожный овод. Н. lineatum. крупный рогатый скот гиподермин С моноклональные антитела, поликлональные антитела. "Сэндвич"-ИФА.
UDC 619 576 89
DETECTION OF HYPODERMA UNEATUM ENZYME
(HYPODERMIN C) IN BOVINE BLOOD SERUM
Nepoklonov AA, Mavrin NA, KostJna LV, Koztov A.Yu, Prokhorova IA
Summary
The "Sandwich"-ELISA based diagnostic test for detection of a hypodermin С in cattle blood serum was developed Purified antigen (hypodermin C). specific mouse monoclonal antibodies and rabbit polyclonal antibodies were received and used as the specific components in this diagnostic system Sensitivity of the developed test is 15-20 ng/ml However detectable amount of the hypodermin С in cattle serum which contained specific antibodies against this antigen was smaller
Key words: warble fly (subcutaneous gadfly) H lineatum cattle hypodermin C. monoclonal antibodies polyclonal antibodies "sandvvich"-EUSA
About the authors
Nepoklonov AA. D Sc. in Veterinary Medicine, professor, chief of laboratory of diagnostics, therapy and preventive maintenance of parasitic diseases of animals of "Diagnostic and Prevention Research Institute for Human and Animal Diseases-(DPRI): 2a. IstGrajvoronovsky blvd.. Moscow. Russia. 109518: +7- 495-916-00-51.
Mavrin N.A.. Ph. D. in Biology microbiologist "Vetbiochem LLC": 3/9. 3rd Syromyatnichesky lane. Moscow. Russia. 117602: e-mail: mavrnik® yandex.ru: +7 -495- 916-17-11
Kostina LV.. Ph. D. in Biology: senior scientist of laboratory of applied virology and biotechnology of D.I. Ivanovsky Virology Institute. 16. Gamalei St.. Moscow. Russia, phone: +7-499-190-78-61.
KozlovA.Yu.. Ph. D. in Biology, senior scientist of laboratory of applied virology and biotechnology of D.I. Ivanovsky Virology Institute. 16. Gamalei St.. Moscow. Russia, phone: +7-499-190-78-61.
Responsible for correspondence with the editorial board:
Prokhorova I.A., D. Sc. In Veterinary Medicine, Marketing and sales director of "VET Traldlng LLC"; 1/38, Academician Anokhln st, Moscow, Russia, 117602; +7-495-916-10-67, e-mail: prokhorova@rosvet.ru
Сведения об авторах
Непоклонов А.А.. доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией диагностики, терапии и профилактики паразитарных болезней животных АНО "Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных": 109518.Россия. Москва. Грайвороновский 1-й пр.. д. 2а. Тел.: +7-495- 916-00-51
Маврин НА., кандидат биологических наук микробиолог ООО "Ветбиохим". 105120 Россия. Москва, пер. 3-й Сыромятнический, д. 3/9. Тел.: +7-495 -916-17-11. e-mail: mavrnik@yandex.ru
Костина Л.В.. кандидат биологических наук старший научный сотрудник. "ФГБУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского". 123098. Россия. Москва, ул. Гамалеи.16. Тел.:+7-499-190-78-61.
Козлов А.Ю.. кандидат биологических наук, старший научный сотрудник "ФГБУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского". 123098Рос-сия. Москва, ул. Гамалеи.16. тел.:+7-499-190-78-61.
Ответственный за переписку с редакцией: Прохорова И.А., доктор ветеринарных наук, директор по маркетингу и продажам ООО "BET Трейдинг", 117602, Россия, Москва, ул. Академика Анохина, д.38, к.1, Тел.:+7-495-916-10-67, e-mail: prokhorova@rosvet.ru
http://vetkuban.com/num2_20119.html