Разработка средств молекулярной диагностики гриппа А

Т.В. Гребенникова, Д.Е. Киреев, А.Д. Забережный, Т.И. Алипер НПО НАРВАК

Грипп А – контагиозное вирусное заболевание, которое вызывает сезонные эпидемии, пандемии и эпизоотии с различным уровнем смертности в зависимости от вирулентности вирусных штаммов, вызвавших эпидемию (1).

Вирус гриппа А широко распространен в природе, инфицирует многие виды млекопитающих и птиц, в основном водного и околоводного комплекса. От диких птиц выделены вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков, при этом инфекция у диких птиц протекает в виде энтерита, без видимых признаков заболевания (3, 4). Это указывает на высокую степень адаптации вирусов гриппа А к диким птицам, которые являются естественными хозяевами вирусов гриппа. Вирус сохраняется в воде в течение длительного времени (6-8 месяцев), а водно-фекальный путь инфицирования является основным механизмом поддержания персистенции вируса гриппа в природе, откуда вирус проникает в популяции домашних животных.

Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Известно 16 антигенных подтипов НА (Н1-Н16) и 9 подтипов NA (N1-N9). Вирус гриппа обладает сегментированным геномом, состоящим из 8 сегментов, которые обладают высокой способностью к реассортации. Различные комбинации НА и NА способны привести к появлению высоковирулентных вирусов, вызывающих высокий процент смертности.

В 20 веке отмечены четыре пандемии: 1918 (H1N1), 1957 (H2N2), 1968 (H3N2) и 1977 (H1N1), причем две (1957 и 1968 гг.) были обусловлены новыми реассортантными вирусами, которые появились в результате реассортации генов вирусов гриппа птиц и человека. Свиньи могут служить промежуточным хозяином, обеспечивающим появление новых вирусов путем адаптации птичьих вирусов и/или реассортации между птичьими и человеческими вирусами (2). В результате этих процессов вирусы птиц смогут репродуцироваться в организме человека, а вирусы человека – в организме птиц. Существует гипотеза, что печально знаменитая "испанка" была вызвана вирусом гриппа свиней А H1N1 (5). За последние 45 лет описано свыше 30 эпизоотий среди домашних животных в ряде случаев сопровождающихся заболеванием людей, подчас с высокой смертностью.

Начиная с 1996 г. и до настоящего времени были отмечены случаи заражения человека подтипами H5 and H7 (3, 4). Наблюдается распространение гриппа птиц, вызванного вирусом H5N1, в странах Азии. С середины декабря 2003 года вспышки этого заболевания были подтверждены в Южной Корее, Вьетнаме, Лаосе, Таиланде, Японии, Камбодже, Филиппинах, Малайзии и Китае (7). При этом отмечался высокий уровень смертности среди людей, до 50% в случае заражения человека подтипом Н5. С января 2004 года во Вьетнаме и Тайланде зарегистрированы случаи с летальностью более 70%. В 2005 г. были зарегистрированы эпизоотии на территории Российской Федерации, вызванные вирусом гриппа H5N1. Считается, что подтипы Н5 и Н7 вируса гриппа А являются наиболее опасными с точки зрения возникновения пандемий.

Угроза возникновения новой пандемии, предупреждение заноса и распространения высоко патогенных вирусов гриппа на территории нашей страны требует проведения мониторинга среди людей, домашних и диких животных с использованием современных средств диагностики. Диагностика гриппа осуществляется вирусологическими, иммунологическими методами и молекулярными методами.  Молекулярные методы диагностики являются чувствительными и специфичными для определения вируса гриппа А. Кроме того, сравнительно в короткий срок, можно получить информацию о возбудителе без предварительного культивирования. Молекулярные методы рекомендованы Всемирной Организации Здравоохранения и Международным Эпизоотическим Бюро как лабораторные тесты для определения вируса гриппа в биологических образцах и постановки диагноза (8, 9 ).

В НПО НАРВАК и  лаборатории молекулярной диагностики института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН разработан комплекс молекулярных методов для индикации и идентификации вируса гриппа А, а также дифференцирования его подтипов. Разработки основаны на современных молекулярных методах и подходах и мегут с успехом использоваться ветеринарными специалистами.

Тест-система для определения РНК вируса гриппа А методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Разработана тест-система для определения РНК вируса гриппа А методом ПЦР. Тест-система является универсальной для млекопитающих и птиц и позволяет определять РНК вируса гриппа А в различных биологических образцах (сыворотках крови, клоакальных смывах и органах) методом ПЦР. С использованием данной тест-системы можно определять РНК, а следовательно наличие вируса гриппа А 16 подтипов. Праймеры, разработанные для тест-системы, специфичны к гену белка нуклеокапсида вируса гриппа А всех известных подтипов и проверены с использованием компьютерных программ "Amplify 1.0", "Oligo 4.0". C использованием программы "ВioEdit" и BLASTN 2.2.3, на 300-400 вирусных геномах каждого подтипа было показано, что праймеры являются универсальными. Тест-система способна выявлять возбудитель гриппа А даже в случае множественных мутаций и реассортации генетического материала.

Тест-система может быть использована для скрининга биологических образцов у млекопитающих и птиц, которые предположительно могут являться носителями вируса гриппа А.

Тест-система для определения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Тест-система определения РНК двух подтипов вируса гриппа А – Н5 и Н7 в биологических образцах. Следовательно, тест-система позволяет не только определять два данных подтипа, но и дифференцировать их от других подтипов вируса гриппа А. Праймеры подобраны к различным участкам гена гемагглютинина и проверены с использованием компьютерных программ "Amplify 1.0", "Oligo 4.0". C использованием программы "ВioEdit" и BLASTN 2.2.3, на 300-400 вирусных геномах для каждого подтипа вируса гриппа А было показано, что даже в случае антигенного дрейфа внутри подтипа Н5 и Н7, или в случае штаммов с множественными мутациями, праймеры работают специфично. Тест-система способна выявлять возбудитель гриппа А подтипов Н5 и Н7 даже в случае множественных мутаций и реассортации генетического материала.

Тест-система для определения РНК вируса гриппа А подтипа Н5 методом ПЦР в реальном времени

Разработана тест-система ПЦР в реальном времени для определения РНК подтипа Н5 вируса гриппа А, а , следовательно наличие вируса гриппа А подтипа Н5. ПЦР в реальном времени является самой современной модификацией ПЦР. Это чувствительный, быстрый и более технологичный метод, который может быть использован для массового анализа образцов от млекопитающих и птиц на наличие РНК разных подтипов вируса гриппа А. Тест-система с успехом апробировалась при скрининге полевого материала, что позволяет рекомендовать ее для массового изучения образцов, полученных от животных и человека. Данный анализ был адаптирован к отечественным реагентам, что существенно для проведения массовых исследований.

С использованием разработанных тест-систем в 2005 г. было проведено исследование более 400 образцов клоакальных смывов, полученных от диких птиц Приморского края. Кроме того, тест-система была проверена на 350 образцах, полученных от диких птиц из Астрахани. Были проверены 150 проб от диких птиц в районе озера Чаны. Были также проверены 78 образцов, полученные из Новосибирской области во время эпизоотии. Исследовали образцы из Астрахани, Кургана, Калмыкии, Китайской Народной Республики, Сибири и других областей. Всего исследовано около 4000 образцов. Описанные тест-системы успешно прошли Государственные контрольные испытания и имеют сертификационные документы.

Разработка технологии микрочипов для  диагностики гриппа.

Одной из современных технологий является создание микрочипов (биочипов), основанных на гибридизации нуклеиновых кислот. Данная технология разработана совместно НПО НАРВАК, НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, НИИ молекулярной биологии им. Энгельгарда РАН для определения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н1-Н15, N1-N2 (6). Микрочип позволяет в короткое время (несколько часов) не только определить наличие вируса гриппа А, но и дифференцировать подтипы вируса гриппа. Технологически, анализ происходить следующим образом: с использованием разработанных универсальных праймеров, специфичных гену гемагглютинина вируса гриппа А, и гену нейраминидазы, получают амплификаты методом ПЦР с использованием РНК, выделенной из биологических образцов. После этого, проводится гибридизации на микрочипе, который содержит набор зондов, специфичных к каждому из подтипов и меченых флюоресцентным красителем. Если гибридизации не произошло, цвет нанесенного зонда не меняется. Если гибридизация произошла – изменяется цвет зонда. Считывание и документирование происходит с использованием специального прибора, который сравнивает каждый зонд с положительным и отрицательным контролем.

По затратам средств и времени один микрочип эквивалентен 17 реакциям (ПЦР). В результате применения микрочипа для анализа образцов из Новосибирской области в 2005 г. сразу было установлено, что это H5N1. Разработанные микрочипы проходят лабораторные испытания. Внедрение нового метода требует дополнительных испытаний, комиссионных испытаний и получения сертификационных документов.

Анализ первичной структуры генома вирусов гриппа (секвенирование)

Вирус гриппа генетически чрезвычайно изменчив и этим опасен. Изменения свойств вируса могут происходить как из-за изменения генов (мутации), так и в ходе обмена генами (реассортация). Поэтому всегда есть угроза появления опасных гибридов: в 1918 г. это был Н1N1, а сегодня это может быть Н5N1. Для лучшего понимания и прогнозирования ситуации, для изучения происхождения и эволюции штаммов вируса гриппа применяют метод секвенирования. Сегодня секвенирование фрагментов вирусного генома является уже обязательным требованием при возникновении новых или спорных вирусных вариантов. Для вируса гриппа установлено, что его патогенность связана с последовательностью аминокислотных остатков в т.н. "сайте протеолитического разрезания" гемагглютинина. Поэтому сегодня этот сайт всегда определяют у выделяемых вирусов гриппа. Раньше у птиц на территории России находили вирус подтипа Н5 с "сайтом протеолитического разрезания" как у низко патогенных штаммов. Сегодняшний вирус Н5N1 имеет "сайт протеолитического разрезания" такой же как у высоко патогенных штаммов и поэтому высоко патогенный для птиц.

Заключение

Грипп остается непредсказуемой инфекцией в настоящее время. Мир может оказаться беззащитным перед новым высоко патогенным пандемическим вариантом, вероятность возникновения которого довольно велика. Поэтому только постоянный мониторинг с использованием современных средств диагностики позволит своевременно выявить, локализовать и обезвредить очаги инфекции.

В отделе молекулярной биологии НПО НАРВАК и в лаборатории молекулярной диагностики Института вирусологии им. Д. И. Ивановского постоянно проводятся молекулярные исследования вируса гриппа с использованием самых современных методик. Данные исследования могут существенно помочь практическим ветеринарным специалистам. Разработаны две тест-системы на основе ПЦР для определения РНК вируса гриппа А и дифференцирования двух подтипов Н5 и Н7 и тест-система для определения РНК вируса гриппа А подтипа Н5 методом ПЦР в реальном времени. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания в 2005 г., имеют все сертификационные документы и могут быть использованы в региональных ветлабораториях.

Список литературы

  1. ЛьвовД.К. Жданов В. М. // Вопр. Вирусол. – 1982. –N 4. – С. 17-20
  2. Brown, I. H., Harris P.A., McCauley J.W, Alexander D.J..// J. Gen. Virol. – 1998. - Vol. 79. - Р. 2947–2955.
  3. Capua I, Alexander DJ. // Acta Trop. - 2002 –Vol. 83. N° 1. – P. 1-6. Review.
  4. Capua I, Mutinelli F, Pozza MD, Donatelli I, Puzelli S, Cancellotti FM. // Acta Trop. - 2002. – Vol. 83. - N 1. – P.7-11.
  5. Fanning T.G., Slemons R.D., Red A.H., Janczewski T.A., Dean J., Taubenberg J.K. 1917 // Journal of Virology. – 2002. - Vol. 76. - No 15. - P. 7860-7862.
  6. Fesenko Е. Е, D.Kireev, D.A. Gryadunov, D.A.Khodakov, A.I. Myznikova, V.M. Mikhailovich, T.V.Grebennikova, A.S. Zasedatelev.// Международный конгресс "Современные проблемы генетики". –Минск. – 2005
  7. Li, Wang J. Smith G. J. D. // Nature. - 2004. – Vol. 430. - P. 209-213.
  8. OIE Reference Laboratories May 2005 http://www.oie.int/eng/OIE/organisation/en_LR.htm
  9. Recommended laboratory tests to identify avian influenza A virus in specimens from humans • WHO Geneva • June 2005.

http://vetkuban.com/num2_20062.html