УДК 636.5.033/59.083
DOI 10.33861/2071-8020-2024-1-21-24
Овчинникова Н. В., Кузьмина И. В. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
Федеральный научный центр «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт
птицеводства», Московская область, г. Сергиев Посад
Птицеводство постоянно развивается благодаря улучшению генетического потенциала сельскохозяйственной птицы, тем самым удовлетворяя потребности населения в высококачественном и недорогом белке. Генетические изменения для более интенсивного роста птицы вместе с уплотненными условиями их содержания могут спровоцировать рост заболеваний среди поголовья. Некоторые исследования показали, что, несмотря на сбалансированность рациона могут снижаться не только продуктивность птицы и эффективность конверсии корма, но и антиоксидантные и иммунные функции организма [7]. Ценную информацию для оценки состояния здоровья птицы представляют гематологические показатели, но из-за отсутствия референсных значений их использование в птицеводстве затруднительно. В имеющихся в свободном доступе исследованиях, абсолютное и относительное количество клеток крови обычно используется в качестве диагностических маркеров состояния здоровья или уровня стресса у птицы. К сожалению, в отличие от крови млекопитающих, кровь птиц содержит ядросодержащие эритроциты и тромбоциты, что затрудняет их анализ. Несмотря на то, что гематологические параметры частично определяются генетически, на показатели крови здоровых птиц влияют и другие факторы: физиологические, условия содержания, состав рациона (добавление витаминов, премиксов, антибиотиков), ограничение воды и корма, голодание, возраст и время года [5].
Основываясь на результатах предыдущих исследований [3], мы предположили, что изменение уровня протеина в питании цыплят-бройлеров может влиять не только на показатели роста, но и на развитие желудочно-кишечного тракта. Что в свою очередь играет жизненно важную роль в обеспечении поддержания здоровья посредством взаимодействия с иммунной системой.
Несмотря на то, что рядом авторов были проведены гематологические исследования у птиц, в настоящее время существует ограниченная информация относительно нормального профиля крови различных кроссов бройлеров в онтогенезе. Для интерпретации показателей крови необходимы эталонные профили крови бройлеров, содержащихся в рекомендуемых условиях и в разных возрастных периодах [11, 14].
Таким образом, целью настоящего исследования была оценка влияния разного уровня протеина в корме на иммунитет цыплят-бройлеров в онтогенезе, с точки зрения состояния здоровья, отраженного гематологическими показателями.
Материалы и методы исследований. Опыты выполняли на 105 цыплятах-бройлерах кросса Смена 9 (ВНИТИП, 2021). Цыплят выращивали с суточного до 35-суточного возраста в виварии ФНЦ «ВНИТИП», где условия кормления и содержания соответствовали требованиям для этого кросса птицы. Эксперименты выполняли в соответствие с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS №123, Страсбург, 1986) [2]. Были сформированы 3 группы, получающие разные уровни протеина в первые 14 дней выращивания: контрольная группа (23,0%), опытная 1 группа (21,5%) и опытная 2 группа (24,5%). Изменение сырого протеина в рационе происходило за счет изменения доли ввода соевого шрота и синтетических аминокислот в период с суточного до 14-суточного возраста.
В конце каждой недели у цыплят-бройлеров брали кровь. Все исследования проводили натощак, после 10-часового голодания, при неограниченном доступе к воде. В 1 и 7 сутки кровь брали путем резекции яремной вены ножницами (метод А.В. Комарова) [15], начиная с 14 суток, образцы крови брали из подкрыльцовой вены. Для измерения количества основных гематологических показателей и лейкограммы крови применяли методику [1] с использованием автоматического анализатора DF50Vet производства компании Dymind Biotech (КНР) с использованием необходимых оригинальных наборов реагентов.
Для статистического анализа использовали компьютерную программу StatTech 3.0.9 (Россия) и Microsoft Excel. Данные в таблицах представлены в виде среднего значения (M) ± стандартной ошибки среднего (SEM). Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента. Результаты считались статистически значимыми, когда p-значение составляло < 0,05.
Результаты исследований и их обсуждение. В ходе проведения опыта были получены данные, которые частично согласуются с ранее проведенными исследованиями [18]. Как видно из таблицы 1, достигая своего максимального значения в 7 (контрольная группа) и 14 (опытная 1 и опытная 2 группы) суток количество лейкоцитов (WBC) имеют тенденцию к снижению с увеличением возраста птицы. Однако, при добавлении в рацион разного уровня протеина наблюдаются различия в количестве WBC. А именно, в опытной 1 группе среднее количество белых кровяных клеток в крови птицы ниже, чем в контрольной и опытной 2 группах. Данный вид клеток крови участвуют в функциональном иммунном ответе и увеличение их количества может свидетельствовать о начале заболевания, развивающегося в организме [4]. Стоит отметить, что в нашем исследовании количество лейкоцитов находится в физиологических границах.
Во всех исследуемых группах прослеживается тенденция к повышению эритроцитов с возрастом, достигая своего максимального значения к 35 суткам выращивания. При добавлении разного уровня протеина в рацион в обеих опытных группах значения показателя RBC ниже относительно контрольной группы. Изменение уровня гемоглобина напоминает прямую линейную зависимость: достигнув минимального значения в 7-суточном возрасте, наблюдается тенденция к повышению его уровня на протяжении дальнейшего периода выращивания во всех группах. Аналогичные изменения наблюдаются во всех исследуемых группах и с уровнем гематокрита в крови бройлеров: от достигнутого высокого значения в суточном возрасте идут на спад (7 суток) и вновь достигают исходного значения к 28-35 суткам выращивания. Стоит отметить, что в опытных группах изменения HGB происходят подобным контрольной группе образом, однако их значения ниже.
Таблица 1 Сравнение основных гематологических показателей крови цыплят-бройлеров в онтогенезе при разном уровне протеина в рационе
| Возраст, сут. | Гематологические показатели | |||
|---|---|---|---|---|
| WBC, 109/л | RBC, 1012/л | HGB, г/л | HCT, % | |
| 1 | 32,1 ± 3,01 | 2,7 ± 0,22 | 132,8 ± 9,7 | 37,5 ± 3,09 |
| Контрольная | ||||
| 7 | 46,4 ± 1,59 | 2,3 ± 0,14 | 130,5 ± 6,53 | 32,6 ± 1,63 |
| 14 | 44,0 ± 1,44 | 2,5 ± 0,08 | 140,4 ± 2,35 | 35,8 ± 0,78 |
| 21 | 32,5 ± 0,56 | 2,6 ± 0,22 | 140,1 ± 11,07 | 36,6 ± 2,40 |
| 28 | 32,7 ± 0,94 | 2,9 ± 0,14 | 152,0 ± 5,28 | 37,7 ± 1,83 |
| 35 | 28,4 ± 0,28 | 2,8 ± 0,19 | 151,4 ± 8,36 | 38,6 ± 2,38 |
| Опытная 1 (меньше) | ||||
| 7 | 32,0 ± 1,51* | 2,0 ± 0,08 | 109,8 ± 2,99* | 27,8 ± 0,69* |
| 14 | 41,2 ± 2,85 | 2,2 ± 0,06* | 125,4 ± 4,12* | 31,8 ± 0,95* |
| 21 | 25,4 ± 1,45* | 2,4 ± 0,09 | 126,4 ± 5,22 | 32,3 ± 1,36* |
| 28 | 23,7 ± 0,75* | 2,4 ± 0,09* | 128,0 ± 4,07* | 32,1 ± 1,19* |
| 35 | 26,5 ± 1,35 | 2,6 ± 0,10 | 134,2 ± 2,87 | 33,3 ± 0,80* |
| Опытная 2 (больше) | ||||
| 7 | 35,1 ± 2,03* | 2,1 ± 0,05 | 113,6 ± 3,14* | 28,9 ± 0,89 |
| 14 | 42,9 ± 3,30 | 2,3 ± 0,06 | 129,2 ± 4,27* | 32,7 ± 1,03* |
| 21 | 29,8 ± 1,53 | 2,6 ± 0,08 | 140,8 ± 4,94 | 35,3 ± 1,30 |
| 28 | 27,2 ± 2,55 | 2,5 ± 0,17 | 133,6 ± 7,32 | 33,7 ± 1,92 |
| 35 | 30,5± 1,40 | 2,8 ± 0,05 | 142,8 ± 3,31 | 36,1 ± 1,08 |
Примечание: * - различия статистически значимы при p < 0,05 по сравнению с суточным возрастом.
У птиц, как у большинства позвоночных есть пять типов лейкоцитов: лимфоциты (Lym), нейтрофилы (Neu), эозинофилы (Eos), базофилы (Bas) и моноциты (Mon). Морфология каждого типа клеток сохраняется во всех таксонах, за исключением случая с нейтрофилами. У птиц и рептилий нейтрофил заменяется гетерофилом (Het), который выполняет ту же иммунологическую функцию. Иммунологическая функция каждого из типов лейкоцитов была подробно рассмотрена в работах других авторов [6]. Вкратце, ней-трофилы/гетерофилы и лимфоциты составляют большинство (то есть почти 80%) лейкоцитов у млекопитающих, птиц, амфибий и рептилий. Нейтрофилы/гетерофилы являются первичными фагоцитарными лейкоцитами и пролиферируют в кровообращении в ответ на инфекции, воспаление и стресс. Лимфоциты же участву- ют в различных иммунологических функциях, таких как выработка иммуноглобулина и модуляция иммунной защиты. Оставшиеся 20% лейкоцитов представляют собой комбинацию: эозинофилов, которые играют определенную роль в процессе воспаления и связаны с защитой от паразитов; моноциты, которые являются долгоживущими фагоцитарными клетками, связанными с защитой от инфекций и бактерий и базофилы, функция которых не совсем понятна, но считается, что они связаны с воспалением.
Наиболее распространенным лейкоцитом у птиц являются лимфоциты. Однако, на рисунке 1 а, б видно, что в суточном возрасте преобладающим типом клеток в лейкоцитарной формуле крови являются гетерофилы. С 7-суточного возраста постэмбрионального периода онтогенеза устанавливается лимфоцитный профиль крови. В 21 (опытные группы) - 28 (контрольная группа) суток, когда процентное содержание основных форм лейкоцитов выравнивается, наступает так называемый «физиологический перекрест» лейкоцитарной формулы крови бройлеров.
Установлено, что нейтрофилы/гетерофилы, будучи фагоцитирующими, размножаются в кровотоке для борьбы с инфекциями [6]. Как известно из литературы [12] соотношение гетерофилов/лим-фоцитов (Het/Lym) отражает устойчивость птицы к заболеваниям и состояние иммунной системы. Впервые, в 1983 году исследователи использовали соотношение Het/Lym у птиц и в настоящее время оно широко используется для оценки благополучия птицы в различных условиях выращивания. Важно отметить, что естественное изменение соотношения Het/Lym у недавно вылупившихся цыплят может быть использовано для оценки будущей восприимчивости к болезням. Цыплята с низким соотношением Het/Lym превосходят цыплят с высоким соотношением Het/Lym по выживаемости, иммунному ответу и устойчивости к сальмонеллезной инфекции. Из данных таблицы 2 видно, что значение соотношения в суточном возрасте составило 2,49, что является самым высоким значением на протяжении всего периода выращивания птицы. В обеих опытных группах значения данного соотношения были ниже контрольной группы, за исключением 21- и 35-суточного возраста. В данных возрастах значения показателя были выше контрольной группы в опытной 1 - на 41% и 16%, соответственно, в опытной 2 -в 2,6 раза и 38%, соответственно. Стоит отметить, что в опытной 1 группе значения ниже, чем в опытной 2. Можно предположить, что вскармливание в первые 14 дней корма с пониженным содержанием протеина положительно отражается на иммунологических реакциях цыплят-бройлеров.
Таблица 2 Значения соотношения гетерофилов к лимфоцитам в крови цыплят-бройлеров в онтогенезе при разном уровне протеина в рационе
| Группа | Возраст, сут. | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 7 | 14 | 21 | 28 | 35 | |
| Контрольная | 2,49 | 0,48 | 0,33 | 0,56 | 1,27 | 0,50 |
| Опытная 1 | 0,32 | 0,21 | 0,79 | 0,53 | 0,58 | |
| Опытная 2 | 0,39 | 0,23 | 1,49 | 0,61 | 0,69 | |
Хорошо известно, что лимфоциты в основном участвуют в регуляции специфических иммунных процессов, в то время как моноциты улучшают врожденную иммунную функцию организма посредством фагоцитоза вторгающихся патогенов [4]. Моноциты и макрофаги играют решающую и отчетливую роль в тканевом гомеостазе и иммунитете, так как являются ключевыми участниками воспаления и борьбы с патогенами. Однако, как показывают последние данные, они могут способствовать развитию широкого спектра патологий, поскольку эти клетки способны распространять патоген и действовать как «троянский конь», перенося бактерии в костный мозг [10]. В ходе нашего эксперимента был выявлен резкий скачок (рисунок 1 в) в опытной 2 группе в 7- и 21-суточном возрасте в 7 и 2,6 раз, соответственно, превышающий значения контрольной группы. В дополнение к этому, в 21-суточном возрасте возникла относительная нейтрофилия и лимфопения, что с общим увеличением количества лейкоцитов могло говорить об инфекции [6]. В нашем исследовании напротив произошло снижение общего количества WBC.
Рис. 1. Содержание гетерофилов (а), лимфоцитов (б), моноцитов (в) и эозинофилов (г) в крови цыплят-бройлеров в онтогенезе при разном уровне протеина в рационе (* - различия статистически значимы при p < 0,05 по сравнению с суточным возрастом)
Следующий параметр, который необходимо рассмотреть, это количество эозинофилов в крови. Точная функция эозинофилов до сих пор неясна [17]. Однако существует мнение, что снижение количества циркулирующих эозинофилов является показателем стресса у животных [9, 19]. Другие авторы [21] также считают, что снижение количества эозинофилов в крови может быть отличительным фактором между реакцией лейкоцитов, вызванной инфекцией, и реакцией, вызванной стрессом. В ходе исследования зарубежными авторами было установлено, что значительное снижение уровня эозинофилов у бройлеров являются маркерами физиологического стресса при незначительном изменении количества моноцитов и базофилов [9]. Существуют некоторые экспериментальные доказательства того, что гормоны стресса снижают количество эозинофилов у амфибий, что в свою очередь приводит к снижению устойчивости к паразитам [6]. Во всех группах изменение количества Eos происходит волнообразно (рисунок 1 г): с суточного значения эозинофилы снижаются, далее повышаются и вновь снижаются и так далее на протяжении всего периода выращивания, достигая мах значения к 28- (опытная группа 1) и 35-суточному возрасту (контрольная группа, опытная группа 2).
Рис. 2. Содержание базофилов в крови цыплят-бройлеров в онтогенезе при разном уровне протеина в рационе
Как видно из рисунка 2 процентное содержание базофилов остается неизменным при любом уровне протеина в корме на протяжении всего периода выращивания, за исключением последних двух недель. В возрасте 28 сут. произошло увеличение количества Bas на 50% в контрольной и опытной 1 группе, а также в опытной 2 группе в 35 суток. Некоторые исследования показывают, что базофилия может возникнуть после сильного стресса у птиц [16].
Гематологический анализ дает ряд преимуществ при оценке состояния здоровья птицы, в первую очередь невысокая стоимость и возможность работы с разными видами. Более того, исследования, проводимые в настоящее время показывают, что профили лейкоцитов могут помочь предсказать будущую производительность и жизнеспособность сельскохозяйственной птицы [8]. Недостаточное поступление питательных веществ может ослабить иммунную систему, что важно для здоровья и благополучия сельскохозяйственной птицы. А использование в птицеводстве особей, устойчивых к патогенам, может значительно повысить микробиологическую безопасность продуктов птицеводства, поступающих к потребителю [13, 20].
Заключение. Полученные в ходе эксперимента данные позволяют предположить, что добавление в корм разного уровня протеина приводит к изменению таких основных гематологических показателей как: лейкоциты, эритроциты, гемоглобин и гематокрит. В лейкоцитарной формуле не было выявлено существенных изменений, за исключением эозинофилов, доля которых была увеличена в обеих опытных группах. Таким образом, наши экспериментальные данные показывают, что даже относительно небольшие (1,5%) изменения содержания сырого протеина в комбикормах для цыплят-бройлеров кросса «Смена 9» влияют не только на морфологический состав крови, но и на организм птицы в целом, что в дальнейшем может стать одним из маркеров оценки ее продуктивности.
Список литературы:
1. Вертипрахов, В. Г. Морфобиохимические исследования крови у сельскохозяйственной птицы: учеб. пособие / В. Г. Вертипрахов, А. А. Грозина, С. В. Карамушкина // Дальневосточный государственный аграрный университет, Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства РАН. 2021. 134 с.
2. Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS № 123). 1986. URL: http:// www.conventions.ru/view_base.php?id=19432
3. Age Dynamics of the Exocrine Pancreatic Function in Broilers as Affected by the Level of Dietary Crude Protein / V. Vertiprakhov, A. Grozina, I. Kislova et al. // Fundamental and Applied Scientific Research in the Development of Agriculture in the Far East. AFE 2021.
4. Carrick J.B., Begg A.P. Peripheral blood leukocytes. Vet Clin North Am Equine Pract. 2008 Aug;24(2):239-59, v. doi: 10.1016/j.cveq.2008.05.003.
5. Comparative studies on haematological values of broiler strains (Ross, Cobb, Arbor-acres and Arian) // A. Talebi, S. Asri-Rezaei, R. Rozeh-Chai et al. // International journal of poultry science. 2005. No. 4 (8): 573-579
6. Davis A. K., Maney D. L., Maerz J. C. Use of leukocyte profiles to measure stress in vertebrates: a review for ecologists // Functional Ecology. P. 760-772.
7. Dietary Soy Saponin Improves Antioxidant and Immune Function of Layer Hens / P. Li, Y. Liu, M. Gao et al. // J Poult Sci. 2022. No. 59 (3): 197-205.
8. Effects of a Dietary Multi-Strain Probiotic and Vaccination with a Live Anticoccidial Vaccine on Growth Performance and Haematological, Biochemical and Redox Status Indicators of Broiler Chickens / A. Arczewska-Wlosek, S. Swi^tkiewicz, K. Ognik et al. // Animals. 2022. No. 12. P. 3489.
9. Evaluation of the hematological and clinical biochemical markers of stress in broiler chickens / C. U. Nwaigwe, J. I. Ihedioha, S.V. Shoyinka et al. // Vet World. 2020. P. 2294-2300.
10. Ginhoux F., Jung S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis // Nat Rev Immunol. 2014. No. 14 (6): 392-404.
11. H/L ratio as a measurement of stress in laying hens - methodology and reliability / T. L. Lentfer, H. Pendl, S. G. Gebhardt-Henrich et al. // Br Poult Sci. 2015. No. 56 (2): 157-163.
12. Heterophil/ Lymphocyte Ratio Level Modulates Salmonella Resistance, Cecal Microbiota Composition and Functional Capacity in Infected Chicken / M. Thiam, Q. Wang, A. L. Barreto Sanchez et al. // Front Immunol. 2022. No. 13. P. 816689.
13. Immunomodulatory Effects of Dietary Phosphorus and Calcium in Two Strains of Laying Hens / T. Hofmann, S. Schmucker, V. Sommerfeld et al. // Animals. 2021. Vol. 11. P. 129.
14. Jahanian R., Rasouli E. Dietary chromium methionine supplementation could alleviate immunosuppressive effects of heat stress in broiler chicks. J Anim Sci. 2015. No. 93 (7): 3355-3363.
15. Koshcheeva M. Age dynamics of the biochemical blood indices in smena-9 broilers В сборнике: Fundamental and Applied Scientific Research in the Development of Agriculture in the Far East. Agricultural Innovation Systems, Volume 2. Ussuriysk, 2022. С. 872-879.
16. Maxwell M. H., Hocking P. M., Robertson G. W. Differential leucocyte responses to various degrees of food restriction in broilers, turkeys and ducks // Br Poult Sci. 1992. No. 33 (1). P. 177-187.
17. Montali R. J. Comparative pathology of inflammation in the higher vertebrates (reptiles, birds and mammals) // J. of Comparative Pathology. Vol. 99. No. 1. P. 1-26.
18. Ovchinnikova N. Characterization of the Dynamics of Physiologically Important Blood Indices in Broilers for Early Disease Diagnostics // Fundamental 24 and Applied Scientific Research in the Development of Agriculture in the Far East : Agricultural Innovation Systems. 2021. Vol. 354. P. 918-924.
19. Sarjan & Sheshadri H. N., Divyashree & Yajurvedi H. The protective effect of the Vacha rhizome extract on chronic stress-induced immunodeficiency in rat. Pharmaceutical Biology. 2017. 55. P. 1358-1367.
20. Selection of broilers with improved innate immune responsiveness to reduce on-farm infection by foodborne pathogens / C. L. Swaggerty, I. Y. Pevzner, H.
He et al. // Foodborne Pathog Dis. 2009. 6 (7): 777-783.
21. Tornquist S. J., Rigas J. Interpretation of ruminant leukocyte responses // Veterinary Hematology. 2010. P. 310.
Резюме. Исследования проводили с целью изучения влияния разного уровня протеина (23,0%; 21,5% и 24,5%) в корме на гематологические показатели крови цыплят-бройлеров. Опыты выполняли на 105 цыплятах-бройлерах кросса «Смена 9» с суточного до 35-суточного возраста. Изменение сырого протеина в рационе происходило за счет изменения доли ввода соевого шрота и синтетических аминокислот в период с суточного до 14-суточного возраста. Кровь для исследования получали еженедельно от 5 голов с каждой группы. В суточном и 7-суточном возрасте - при убое. В остальные возрастные периоды - из подкрыльцовой вены. При добавлении в рацион разного уровня протеина наблюдаются различия в количестве лейкоцитов, а именно, в опытной 1 группе данный показатель был ниже, чем в контрольной и опытной 2 группах. Во всех исследуемых группах прослеживается тенденция к повышению эритроцитов с возрастом. При изменении уровня протеина в рационе в обеих опытных группах значения данного показателя был ниже относительно контрольной группы. В суточном возрасте преобладающим типом клеток в лейкоцитарной формуле крови являются гетерофилы (Het), с 7-суточного возраста устанавливается лимфоцитный (Lym) профиль крови, в 21 (опытные группы) - 28 (контрольная группа) суток наступает так называемый «физиологический перекрест» лейкоцитарной формулы крови бройлеров. В ходе нашего эксперимента был выявлен резкий скачок моноцитов (Mon) в опытной 2 группе в 7- и 21-суточном возрасте в 7 (р<0,05) и 2,6 раз (р<0,05) соответственно превышающий значения контрольной группы. Изменение количества эозинофилов (Eos) происходит волнообразно во всех группах. В возрасте 28 сут. произошло увеличение количества базофилов (Bas) на 50% в контрольной и опытной 1 группе (р<0,05), а также в опытной 2 группе (р<0,05) в 35 суток. Основываясь на приведенных выше наблюдениях, мы пришли к выводу, что изменение ингредиентного состава корма в первые две недели выращивания влияет на морфологические показатели крови цыплят-бройлеров.
Ключевые слова: цыплята-бройлеры, протеин, иммунитет, эритроциты, лейкоциты, гемоглобин, гематокрит, гетерофилы, лимфоциты, моноциты, базофилы, онтогенез.
Сведения об авторах:
Овчинникова Наталья Владимировна, соискатель, младший научный сотрудник лаборатории физиологии ФГБНУ ФНЦ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства»; 141311, Московская область, г. Сергиев Посад, ул. Птицеградская, 10; e-mail: natalya.o90@mail.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Кузьмина Ирина Викторовна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник лаборатории физиологии ФГБНУ ФНЦ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства»; 141311, Московская область, г. Сергиев Посад, ул. Птицеградская, 10; e-mail: irina.kislova1606198@yandex.ru.
http://vetkuban.com/num1_202404.html