УДК 619:615.91:636.028
Шахов А.Г., Сашнина Л.Ю., Востроилова Г.А., Лагуткин Д.А., Черницкий А.Е.
ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии,
фармакологии и терапии" Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Воронеж
Микотоксикозы животных широко распространены и наносят большой экономический ущерб народному хозяйству. Чаще всего их вызывают Т-2 токсин, зеара-ленон, ДОН (вомитоксин), фумонизин, афлатоксин, охратоксин и патулин [2].
Т-2 токсин относится к трихотеценовым микотоксинам, под влиянием которых происходят значительные повреждения активно делящихся клеток в костном мозгу, лимфатических узлах, селезенке, тимусе и слизистой оболочке кишечника [7, 12].
Установлено иммуносупрессивное действие Т-2 токсина и других трихоцетеновых микотоксинов на клеточный и гуморальный иммунитет животных и человека [1, 6].
Показана способность трихоцетеновых микотоксинов усиливать продукцию цитокинов, участвующих в регуляции фагоцитоза и окислительном метаболизме макрофагов и нейтрофилов [15, 19].
В работах ряда исследователей, изучавших изменения в цитокиновом профиле лабораторных мышей и крыс при Т-2 токсикозе, прослеживаются некоторые параллели, но отдельные экспериментальные данные не согласуются между собой или вовсе противоречат друг другу. Так, одни исследования [11, 18] показали, что под действием Т-2 токсина концентрации провоспалитель-ных цитокинов TNF-а и IL-1p повышаются, а другие - указывают на супрессию синтеза этих медиаторов [13] или на дозозависимое угнетение продукции IL-1p, TNF-а, IL-4 и IL-10 [10]. Некоторые авторы не выявили влияния Т-2 токсина на выработку IL-1p и TNF-а, но получили данные о значительном угнетении синтеза и секреции IFN-y [17].
Известно также, что под влиянием трихотеценов в целом и Т-2 токсина, в частности, усиливаются продукция активных форм кислорода (АФК) и интенсивность процессов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) [14].
В свою очередь, продукты ПОЛ влияют на многие клеточные сигнальные пути, в том числе на белковые каскады взаимодействий, ведущие к синтезу цитокинов [16].
В связи с этим изучение роли состояния системы "пероксид-ное окисление липидов - антиоксидантная защита" (ПОЛ-АОЗ) в развитии нарушений иммунитета при Т-2 токсикозе, в частности, продукции цитокинов лимфоцитами и другими иммунокомпетен-тными клетками, представляет как теоретический, так и практический интерес для профилактики и терапии заболеваний, возникающих на фоне подострой интоксикации.
Цель исследования. Оценка подострого действия Т-2 токсина на процессы пероксидного окисления липидов, состояние системы антиоксидантной защиты и взаимосвязи их с содержанием цитокинов в крови у белых крыс.
Материалы и методы. Опыты проведены на половозрелых беспородных белых крысах с массой тела 230-250 г. Животных содержали в условиях вивария ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии в стандартных пластиковых клетках (по 8-10 гол.) на подстилке из опилок лиственных пород деревьев в соответствии с правилами группового содержания. Температуру воздуха поддерживали в пределах +18...+23°С, относительную влажность - 45-60%, которые регистрировали ежедневно. Доступ к воде и корму был свободным. Опытные группы белых крыс формировали по принципу аналогов, используя в качестве критерия массу тела (различия по средней массе животных не превышали 10-12%). Содержание, кормление и манипуляции над ними проводили в соответствии с положением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в эксперименте (Страсбург, 1986), и правилами лабораторной практики в Российской Федерации (ГОСТ Р53434-2009. Принципы надлежащей лабораторной практики. Принят 2 декабря 2009).
В предварительных опытах были изучены параметры острой токсичности Т-2 токсина на белых крысах при пероральном введении, в результате установлена среднелетальная доза ЛД50, которая составила 2,8 мг/кг массы тела животных.
Для опыта было подобрано 3 группы белых крыс. Первая (контрольная) - интактные животные (n = 12), которые находились на полноценном рационе. Подострую интоксикацию белых крыс второй (n = 12) и третьей (n = 12) групп вызывали путем ежедневного введения с кормом Т-2 токсина в течение 6-ти суток в дозах 1/20 ЛД50 (140 мкг/кг) и 1/5 ЛД50 (560 мкг/кг) соответственно.
В эксперименте использовали Т-2 токсин, полученный из ФГБУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" (г. Казань) в виде 5%-ного водноспиртового раствора, который тщательно ступенчато смешивали с основным рационом.
Через сутки после последнего введения Т-2 токсина у опытных и одновременно у интактных животных в крови определяли содержание малонового диальдегида (МДА) - промежуточного продукта ПОЛ, показатели системы антиоксидантной защиты (активность каталазы, глутатионпероксидазы, концентрацию витаминов А и Е), гематологический и цитокиновый профиль. Кровь для проведения исследований получали из сердца у наркотизированных животных. В качестве антикоагулянта использовали 1%-ный раствор гепарина.
Концентрацию МДА и показатели системы антиоксидантной защиты (АОЗ) в крови и печени крыс определяли в соответствии с "Методическими положениями по изучению процессов свободнорадикального окисления и системы антиоксидантной защиты организма" [5].
Морфологический анализ крови проводили на гематологическом анализаторе Micros-60 ("Horiba ABX", Франция). Абсолютное и относительное число Т-лимфоцитов определяли методом спонтанного (Е-РО) розеткообразования с эритроцитами морской 15 свинки, В-лимфоцитов - с помощью комплементарного (ЕАС-РО) розеткообразования [9].
Концентрацию иммунорегуляторных цитокинов ИФН-у, IL-2 и IL-4, провоспалительных IL-1p, TNF -а и IL-8 и противовоспалительного медиатора IL-10 исследовали в плазме крови белых крыс методом иммуноферментного анализа согласно утвержденным методикам к соответствующим диагностическим наборам "Век-тор-Бест" (Россия).
Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием корреляционного анализа и t-теста для независимых переменных в программе Statistics v. 8.0 ("StatSoft Inc.", США).
Результаты исследования. Клинические признаки интоксикации у крыс проявлялись в виде угнетения двигательной активности, гиперемии видимых слизистых оболочек, взъерошенности шерсти, снижением реакции на внешние раздражители и массы тела, которая через 6 суток у животных, получавших токсин в дозе 140 мкг/кг, была ниже на 9,8% (238,1±5,92 г) по сравнению с таковой в начале опыта (258,2±2,61 г) (P<0,05), а при увеличении его количества до 560 мкг/кг на 13,3% (228,8±9,14 г) при исходной массе 258,8±10,5 г (P<0,05).
Т-2 токсикоз сопровождался активацией процессов ПОЛ, на что указывало повышение в крови концентрации МДА. Его содержание в крови крыс, подвергнутых интоксикации в дозе 140 и 560 мкг/кг, возросло в 2,14 и 3,12 раза, соответственно, по сравнению с таковым у интактных животных (P<0,05) (табл. 1).
Результаты определения концентрации МДА в печени животных также подтвердили дозозависимый эффект повышения интенсивности ПОЛ при Т-2 токсикозе: введение токсина в дозе 140 мкг/кг вызвало увеличение содержания МДА в печени в 5,1 раза (P<0,05), а в количестве 560 мкг/кг - в 9,7 раза (P<0,05) по сравнению с контролем (табл. 1).
Таблица 1. Концентрация малонового диальдегида в крови и печени белых крыс (мкмоль/л)
| Объект исследования | Контроль | Т-2 токсин, мкг/кг | |
|---|---|---|---|
| 140,0 | 560,0 | ||
| Кровь | 1,14±0,05 | 2,44±0,09* | 3,56±0,09* |
| Печень | 1,46±0,15 | 7,41±0,54* | 14,13±1,49* |
* - разница по отношению к контролю достоверна при P<0,05
Установлено, что под влиянием Т-2 токсина в дозах 140 и 560 мкг/кг активность каталазы в крови у белых крыс снизилась на 25,7 и 28,0% (P<0,05), соответственно, по сравнению с таковой у интактных животных, при этом активность селензависимой глутатионпе-роксидазы (ГПО) существенно не изменилась. В физиологических условиях между активностью каталазы и ГПО в крови существует прямая линейная зависимость (R=+0,89, при P<0,05), обусловленная идентичностью субстрата (пероксид водорода) для этих ферментов [8]. Полученные результаты указывают на то, что повышение продукции пероксида водорода в условиях подострого Т-2 токсикоза у белых крыс связано, в первую очередь, с ингибированием каталазы, но не глутатионпероксидазы.
Значительные изменения наблюдали и в неферментативном звене системы АОЗ. Так, содержание в плазме крови витамина Е у белых крыс при введении Т-2 токсина в дозах 140 и 560 мкг/кг снизилось на 58,6 и 61,4% (P<0,05), а витамина А - в 2,8 и 3,3 раза (P<0,05) соответственно по сравнению с контролем (табл. 2).
Функциональная недостаточность ферментативного и неферментативного звеньев системы АОЗ при подостром Т-2 токсикозе у крыс сопровождалась интенсификацией процессов ПОЛ и повышенным накоплением в крови малонового диальдегида и других токсичных продуктов. Известно, что избыточные концентрации продуктов ПОЛ в крови оказывают негативное влияние на иммунокомпетентные клетки, снижая их способность к пролиферации и изменяя соотношение регуляторных субпопуляций, нарушает синтез ДНК и белка в лимфоцитах, сопровождающийся подавлением иммунных реакций [8, 16].
Таблица 2. Показатели ферментативного и неферментативного звеньев системы антиоксидантной защиты у белых крыс (M±m)
| Показатели | Интактные | Т-2 токсин, мкг/кг | |
|---|---|---|---|
| 140,0 | 560,0 | ||
| ГПО, ммоль GSH/(лЧмин) | 9,74±0,74 | 10,88±0,27 | 9,18±0,27 |
| Каталаза, мкмоль Н2О2/ (лхмин) | 28,55±1,32 | 21,20±1,14* | 20,55±0,97* |
| Витамин А, мкмоль/л | 11,78±0,77 | 4,17±0,33* | 3,60±0,05* |
| Витамин Е, мкмоль/л | 19,24±1,40 | 7,97±0,18* | 7,43±0,55* |
GSH - восстановленный глутатион, Н2О2 - пероксид водорода, * - разница по отношению к контролю достоверна при P<0,05
При изучении цитокинового профиля установлено, что подострая интоксикация Т-2 токсином в количестве 140 и 560 мкг/кг сопровождалась невысоким дозозависимым увеличением (на 4,3 и 19,7%) в плазме крови содержания интерлейкина IL-1P (табл. 3), который одним из первых включается в ответную защитную реакцию организма при действии патогенных факторов. Он инициирует и регулирует воспалительные, иммунные процессы, активирует нейтрофилы [3]. Повышение уровня цитокина IL- 1р, который стимулирует выход нейтрофилов из костного мозга, сочеталось с незначительным увеличением содержания в крови лейкоцитов (на 6,6 и 7,7%) за счет сегментоядерных (на 23,5 и 14,6%) и палочкоядерных (на 9,1 и 18,2%) нейтрофилов. Уровень других провоспалительных медиаторов IL-8 и TNF-а, участвующих в неспецифической защите организма, был снижен в зависимости от доз токсина, соответственно, на 17,1 и 21,5%; и 9,7 и 15,9% (табл. 3), что свидетельствует об угнетении токсикантом активности продуцирующих их моноцитов, макрофагов и других клеток [4].
Таблица 3. Содержание цитокинов в плазме крови белых крыс (пг/мл)
| Цитокины | Контроль | Т-2 токсин, мкг/кг | |
|---|---|---|---|
| 140,0 | 560,0 | ||
| IL-1P | 67,8 ±16,3 | 70,7±6,64 | 81,2±7,87 |
| IL-2 | 249,7±31,07 | 204,5±5,3 | 187,6±18,06 |
| IL-4 | 46,3±1,36 | 39,9±2,71* | 43,6±7,60 |
| IL-8 | 109,7±27,82 | 90,9±14,92 | 86,1±23,14 |
| IL-10 | 69,7±20,84 | 46,2±2,44 | 38,2±5,45 |
| ИФН-у | 343,9±46,43 | 250,1±40,21 | 306,5±22,59 |
| TNF -а | 85,8±2,09 | 77,5±2,61* | 72,2±5,78 |
| ИФН-у/ IL-4 | 7,4 | 6,3 (-15,7%) | 7,0 (-5,3%) |
* - разница по отношению к контролю достоверна при P<0,05
Под влиянием Т-2 токсина происходило также снижение по сравнению с контролем содержания цитокинов IL-2 на 18,1 и 24,9% и IL-4 на 13,8 и 5,9%, стимулирующих соответственно клеточный и гуморальный иммунитет, противовоспалительного медиатора IL-10 на 33,7 и 45,2%, а также иммунорегуляторного цитокина ИФН-у на 27,3 и 10,9% (табл. 3). Снижение содержания цитокина IL-2, который является фактором роста Т-лимфоцитов и стимулирует иммунный ответ за счет активации Т-клеточных популяций, и ИФН-у, одной из функций которого является усиление цитотоксических реакций, опосредованных Т-лимфоцитами и NK-клетками [7], связано с супрессией Т-2 токсином их продукции Т-клетками, о чем свидетельствует уменьшение в крови на 10,7 и 13,0% относительного количества Т-лимфоцитов и на 12,4 и 14,0% их абсолютного числа (табл. 4).
Снижение под воздействием токсиканта концентрации IL-4, являющегося В-клеточным фактором роста, стимулирующим выработку иммуноглобулинов, который продуцируется, главным образом, популяцией Т-хелперных лимфоци-тов 2 типа, сочеталось с уменьшением в крови животных на 17,1 и 12,2% абсолютного количества В-лимфо- цитов (табл. 4).
Таблица 4. Морфологические показатели крови белых крыс (M±m)
| Показатели | Интактные | Т-2 токсин, мкг/кг | |
|---|---|---|---|
| 140,0 | 560,0 | ||
| Лейкоциты, 109/л | 6,5±0,21 | 6,9±0,11* | 7,0±0,17* |
| Нейтрофилы палочкоядерные, % | 1,1±0,07 | 1,2±0,17 | 1,3±0,09* |
| Нейтрофилы сегментоядерные, % | 37,1±2,93 | 45,8±2,35* | 42,5±0,96* |
| Лимфоциты, % | 55,6±2,57 | 49,0±2,02* | 51,2±3,56 |
| абс., 109/л | 3,65±0,21 | 3,69±0,47 | 3,58±0,53 |
| Т-лимфоциты, % | 34,7±0,23 | 31,0±1,43 | 30,2±1,86 |
| абс.,109/л | 1,21±0,17 | 1,06±0,17 | 1,04±0,22 |
| В-лимфоциты, % | 9,3±0,83 | 9,8±1,05 | 10,3±0,97 |
| абс.,109/л | 0,41±0,06 | 0,34±0,08 | 0,36±0,08 |
* - разница по отношению к контролю достоверна при P<0,05
Снижение в крови содержания противовоспалительного медиатора IL-10, вероятно, связано с поражением Т-2 токсином Th0, Th2- лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и В-клеток.
Под воздействием Т-2 токсина уменьшается соотношение ИФН- Y/IL-4 на 15,7 и 5,3%, что свидетельствует о большей супрессии функции 1И1-клеток, чем Th2-лимфоцитов.
Для выяснения взаимосвязи интенсивности процессов ПОЛ и состояния системы АОЗ с цитокиновым профилем нами был проведен корреляционный анализ результатов исследований этих систем с определением коэффициента Пирсона (R).
Проведенный анализ показал, что между отдельными показателями изучаемых систем существует корреляционная взаимосвязь различной степени выраженности (табл. 5).
Таблица 5. Коэффициенты корреляции между активностью антиоксидантных ферментов, содержанием цитокинов и концентрацией МДА в крови белых крыс при Т-2 токсикозе
|
| Т-2 токсин, мкг/кг | |
|---|---|---|
| 140 | 560 | |
| МДА | ||
| ГПО | -0,13 | -0,45* |
| Каталаза | -0,58* | -0,91* |
| IL-1P | +0,44* | +0,92* |
| IL-2 | -0,21 | -0,96* |
| IL-4 | -0,91* | -0,75* |
| IL-8 | -0,17 | -0,92* |
| IL-10 | -0,68* | -0,96* |
| TNFa | -0,57* | -0,62* |
| IFNy | -0,66* | -0,93* |
* - P<0,05
Из данных таблицы 5 видно, что при введении крысам Т-2 токсина в дозе 140 мкг/кг между концентрацией МДА и активностью ката- лазы в крови животных наблюдалась обратная зависимость (R=-0,58, при P<0,05), которая усиливалась (R=-0,91, при P<0,05) с повышением дозы токсина (560 мкг/кг).
При введении животным Т-2 токсина в дозе 140 мкг/кг между концентрацией МДА и активностью ГПО в крови статистически значимой зависимости не наблюдалось. При увеличении дозы токсина до 560 мкг/кг между исследуемыми параметрами появлялась слабая обратная зависимость (R=-0,45, при P<0,05), что, вероятно, связано с повышенным образованием пероксида водорода и возросшей нагрузкой на ферментативное звено системы АОЗ. Достоверной зависимости между концентрацией МДА и содержанием витаминов А и Е в крови крыс не выявлено.
Установлено также, что активация ПОЛ под влиянием Т-2 токсина является одним из факторов, способствующих формированию цитокинового дисбаланса. Коэффициент корреляции между уровнем IL-10 и концентрацией МДА в крови животных под действием Т-2 токсина составил +0,44 и +0,92 (P<0,05). При исследовании взаимосвязи содержания других цитокинов - IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IFNy и TNFa - и концентрации МДА в крови была выявлена обратная зависимость: коэффициенты корреляции (R) составили от -0,17 до -0,91 (140 мкг/кг) и от -0,62 до -0,96 (560 мкг/кг).
Полученные результаты свидетельствуют о прямой зависимости между содержанием IL-1p и малонового диальдегида, что объясняется активацией экспрессии гена данного медиатора при оксидативном стрессе [16]. Обратные зависимости между содержанием МДА в крови крыс и концентрациями других исследуемых цитокинов, вероятно, обусловлены их инактивацией активными формами кислорода, образующимися в процессе свободнорадикального окисления, а также снижением количества продуцирующих их клеток под влиянием Т-2 токсина.
Заключение. Таким образом, патогенные эффекты Т-2 токсина in vivo в значительной степени связаны с функциональной недостаточностью системы АОЗ и избыточным образованием активных форм кислорода. Накопление в крови токсичных продуктов ПОЛ под влиянием Т-2 токсина приводит к нарушению синтеза цитокинов иммунными клетками, повреждению их биомембран и, вероятно, апоптозу. Эти процессы находят отражение в дисбалансе популяций иммуноцитов и продуцируемых ими цитокинов, что неблагоприятно сказывается на устойчивости организма к патогенам.
Полученные данные свидетельствуют о необходимости снижения негативного воздействия на животных Т-2 токсина, поступающего с кормами, путем применения не только эффективных сорбентов, но и антиоксидантных препаратов и средств, корригирующих постинток-сикационные нарушения иммунного гомеостаза.
Список литературы
Резюме. Изучены показатели системы "пероксидное окисление липидов-антиоксидантная защита", цитокиновый профиль и их взаимосвязь у белых крыс при экспериментальном подостром Т-2 токсикозе. Исследование проведено на беспородных крысах массой 230-250 г. Было сформировано 3 группы по 12 животных. Крысы первой группы (интактные) служили контролем. Подострую интоксикацию у животных второй и третьей групп вызывали путем ежедневного введения с кормом Т-2 токсина в течение 6-ти суток в дозах 1/20 ЛД50 (140 мкг/кг) и 1/5 ЛД50 (560 мкг/кг), соответственно. Через сутки после последнего введения Т-2 токсина у опытных и интактных крыс в крови и печени определяли содержание малонового диальдегида (МДА), показатели системы антиок-сидантной защиты (активность каталазы, глутатионпероксидазы, концентрацию витаминов А и Е), лейкограмму, содержание T- и B-лимфоцитов, цитокиновый профиль. Установлен дозозависимый эффект накопления МДА в крови и печени крыс при Т-2 токсикозе, связанный с ингибированием каталазы и снижением концентрации неферментативных антиоксидантов в крови. Показано, что повышение интенсивности пероксидного окисления липидов (ПОЛ) под влиянием Т-2 токсина является одним из факторов, способствующих формированию цитоки-нового дисбаланса. Делается заключение о том, что патогенные эффекты Т-2 токсина in vivo связаны с усилением продукции активных форм кислорода и накоплением в крови токсичных продуктов ПОЛ, что приводит к нарушению синтеза цитокинов иммунными клетками, повреждению их биомембран и, веро-ятно, апоптозу. Эти процессы находят отражение в дисбалансе популяций иммуноци-тов и продуцируемых ими цитокинов, что неблагоприятно сказывается на устойчивости организма к патогенам. Результаты исследования свидетельствуют о необходимости снижения негативного воздействия на животных Т-2 токсина, поступающего с кормами, путем применения эффективных сорбентов, антиок-сидантных препаратов и средств, корригирующих постинтоксикационные нарушения иммунного гомеостаза.
Ключевые слова: белые крысы, Т-2 токсин, кровь, печень, малоновый диальдегид, пероксидное окисление липидов, антиоксиданты, цитокины, лимфоциты, иммунитет.
Сведения об авторах:
Шахов Алексей Гаврилович, доктор ветеринарных наук, профессор, член-корреспондент РАН, главный научный сотрудник лаборатории микробиологии, вирусологии и иммунологии Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии Российской академии сельскохозяйственных наук; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114б; тел. 8 (473) 253-93-54; e-mail: a.g.shakhov@mail.ru.
Сашнина Лариса Юрьевна, доктор ветеринарных наук, заведующая лабо-раторией экологического мониторинга Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института па-толо-гии, фармакологии и терапии Российской академии сельскохозяйственных наук; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114б; тел. 8 (473) 253-93-54; e-mail: l.yu.sashnina@mail.ru.
Востроилова Галина Анатольевна, доктор биологических наук, заведующая отделом фармакологии Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии Российской академии сельскохозяйственных наук; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114б; тел. 8 (473) 253-93-54; e-mail: gvostroilova@ mail.ru.
Лагуткин Денис Анатольевич, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии Российской академии сельскохозяйственных наук; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114б; тел. 8 (473) 253-93-54; e-mail: sonicshot@bk.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Черницкий Антон Евгеньевич, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией патофизиологии Государственного научного учреждения Всероссийского научноисследовательского ветеринарного института патологии, фармакологии и терапии Российской академии сельскохозяйственных наук; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114б; тел. 8 (952) 100-95-45; e-mail: cherae@mail.ru.
http://vetkuban.com/num1_201606.html