Терехов В.И. ГКУ КСББЖ "Краснодарская", г. Краснодар
Несмотря на внедрение в животноводстве современных технологий, предусматривающих инновации не только в содержании, но и в ветеринарном сопровождении, проблемы инфекционных патологий и особенно факторных, остаются актуальными [9]. По-прежнему подавляющее количество случаев факторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных, сопровождающихся диарейным синдромом, связано с Escheriohia coli [2].
Установлено, что в развитии массовых кишечных инфекций у молодняка животных в основном участвуют токсигенные E.coli, продуцирующие термолабильный (TL), термостабильный (TS), шигаподобные (STX I, II) и другие токсины [3, 8, 10, 12].
В настоящее время токсигенные E.coli выявляют с помощью методов, позволяющих обнаружить у бактерий как гены, отвечающие за выработку токсинов, так и собственно продуцируемые ими токсины. К ним относятся полимеразно-цепная реакция, твердофазный радиоиммунологический, ганглиозид-иммуноферментный метод, тест Бикена, реакция коагглютинации, культурально-клеточные исследования (цитотоксичность), проба отека мышиной лапы, метод лигирования петель кишечника кролика и анальная проба на мышах сосунах [3, 11]. Данные методы являются дорогостоящими, трудновоспроизводимыми, дефицитными по используемым реагентам, а некоторые из них не соответствуют требованиям комиссии по проблемам этики отношения к животным Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук.
Между тем лабораторной практике известен достаточно простой метод тестирования токсичности кормов (качественный метод определения наличия микотоксинов) с помощью инфузорий [1].
В связи с этим цель работы состояла в разработке метода биотестирования токсигенности E.coli с использованием инфузорий.
Материалы и методы исследований. В работе использовали инфузорий 4 видов - Paramecium caudatum, Stylonychia mytilus, Colpoda steinii и Tetrahymena pyriformis. Культивирование инфузорий осуществляли в среде Лозина-Лозинского.
Тест-объектами служили непатогенный штамм E.coli М-17 (положительный контроль), являющийся пробиотическим (препарат "Колибактерин") и патогенные штаммы E.coli из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалея и изолированные от больных телят и поросят в из хозяйств Краснодарского края. Наличие генов патогенности устанавливали методом ДНК-диагностики в Центральном НИИ эпидемиологии (г. Москва) и НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея (г. Москва). Для выявления специфических участков ДНК генов шигатоксина I типа (STX 1), шигатоксина II типа (STX 2), термостабильного (ST) и термолабильного (LT) токсинов, цитотоксического некротизирующего фактора (0NF) и гемолизина (GEM) использовали тест-системы "АмплиСенс E.Coli-tox" ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ и экспериментально изготовленные тест-системы в ВНИИЭМ. Культивирование эшерихий осуществляли в бульоне Хоттингера, который служил также в качестве отрицательного контроля.
Алгоритм исследования состоял в следующем. На предметное стекло наносили 3 капли суточной среды культивирования инфузорий, после чего проводили подсчет их количества (для удобства подсчета желательно, чтобы количество инфузорий составляло 10-20 особей в поле зрения) с помощью бинокулярной лупы или микроскопа (увеличение 2 * 8), затем добавляли 1 каплю бульонной тест-культуры E.coli. Спустя 5 минут производили предварительный просмотр и подсчет количества живых инфузорий, для того чтобы исключить погрешность, связанную с влиянием различных факторов окружающей среды (запах, колебания температуры, осмотического давления), так как инфузории являются весьма чувствительными к ним. После просмотра, стекла с инфузориями помещали в чашки Петри, которые ставили в термостат с температурой 18-23°С (оптимальная для жизни инфузорий). Чтобы капли с инфузориями не высыхали, на дно чашки клали фильтровальную бумагу, смоченную водопроводной водой. По истечении 2-х часов производили окончательный подсчет числа живых инфузорий, который сравнивали с первоначальным значением. Погибшими считали только лизированные особи. Для получения наиболее достоверных данных, опыт дублировали 3 раза, после чего подсчитывали средний показатель.
Работа включала 3 этапа, по результатам которых предстояло:
Результаты исследований. Результаты первого этапа экспериментальной работы представлены в таблице 1, из которой видно, что различные виды инфузорий по-разному реагировали на культуры эшерихий. Так, инфузории видов Paramecium caudatum и Colpoda steinii не только не погибали, но даже в ряде случаев размножались в присутствии бульонных культур как не патогенной, так и патогенной кишечной палочки.
Инфузории вида Tetrahymena pyriformis оказались вообще не пригод-ными для тестирования эшерихий, поскольку они гибли как после добавления культуры токсигенного штамма E.coli О157Н7, так и пробиотического штамма E.coli M-17, а также стерильного бульона Хоттингера.
Инфузории Stylonychia mytilus в значительной степени реагировали на внесение культуры E.coli О157:Н7. Установлено, что количество погибших инфузорий после 2-часового контакта с культурой эшерихий данного штамма было достоверно большим, чем после контакта с бульоном Хоттингера и культурой апатогенной E.coli М-17.
Таблица 1. Чувствительность разных видов инфузорий к суточной культуре E.coli
| Тестируемый штамм | Гибель инфузорий, % | |||
|---|---|---|---|---|
| Paramecium caudatum | Stylonychia mytilus | Colpoda steinii | Tetrahymena pyriformis | |
| E.coli О157:Н7 | 0 | 23±1,15* | размножились | 35±8,33 |
| E.coli М-17 (контроль) | 0 | 2±2,0 | размножились | 20±6,85 |
| Бульон Хоттингера (контроль) | размножились | 2±1,0 | размножились | 20±5,45 |
* - Р<0,005 по отношению к контролю и E.coli М-17
Следовательно, результаты проведенных исследований показали, что для тестирования токсигенных эшерихий можно использовать лишь один вид инфузорий - Stylonychia mytilus, так как только он оказался специфически чувствительным к токсинам E.coli. Остальные виды инфузорий были либо вообще не чувствительными к продуктам метаболизма эшерихий (Paramecium caudatum и Colpoda steinii), либо наоборот - слишком чувствительными к ним и стерильной питательной среде (Tetrahymena pyriformis).
Существенным было то обстоятельство, что гибель стилонихий сопровождалась полным распадом клеток инфузориий, что весьма удобно при подсчете оставшихся в живых особей простейших.
Тестирование полевых штаммов эшерихий, у которых методом ДНК-диагностики было подтверждено наличие генов, отвечающих за образование различных токсинов, показало, что стилонихии по разному реагируют на культуральную среду различных вариантов бактерий. Как видно из материалов таблицы 2, все взятые в опыт штаммы E.coli реализуют свой генетический потенциал, продуцируя эк-зотоксины, обуславливающие в той или иной степени гибель инфузорий. Наибольшее (45,0±2,30%) количество погибших Ц инфузорий наблюдали после их контакта с культурой штамма E.coli 174, у которого установлены гены гемолизина, некротизирующего фактора и шигатоксина. Культуры эшерихий, вырабатывающих только шигатоксин (E.coli О157:Н7, E.coli 44 ) или термостабильный токсин (E.coli 533), обуславливали гибель порядка 18-23% инфузорий. Менее токсичной для Stylonychia mytilus оказалась культура штамма E.coli 546, продуцирующего только термолабильный токсин и культура штамма E.coli 196, продуцирующего только гемолизин. После 2-х часовой экспозиции стилонихий с данными культурами наблюдали гибель 7-13% инфузорий.
Таблица 2. Чувствительность инфузорий Stylonychia mytilus к суточным культурам эшерихий
| Штамм кишечной палочки | Количество погибших инфузорий, % |
|---|---|
| E.coli О157:Н7 (STX1, 2) | 23,3±1,15* |
| E.coli 546 (LT) | 12,6±0,85* |
| E.coli 533 (ST) | 20,8±1,45* |
| E.coli 44 (STX1, 2) | 19,6±1,25* |
| E.coli 196 (GEM) | 7,0+0,30* |
| E.coli 174 (GEM, NF STX) | 45,0+2,30* |
| E.coli М-17 (контроль) | 2,0±1,0 |
| Бульон Хоттингера (контроль) | 1,0±0,20 |
* - Р<0,005 по отношению к контролю и E.coli М-17
В контроле гибель инфузорий была в пределах 1-2%, что может отражать их естественную гибель.
Таким образом, установлено, что Stylonychia mytilus обладают специфической чувствительностью к экзометаболитам патогенных эшерихий. В большей степени действуют летально на данных инфузорий шигатоксин и термостабильный токсин, в меньшей степени - термолабильный токсин и гемолизин. Наибольший процент гибели стилонихий вызывала культуральная среда E.coli 174, содержащая несколько токсических экзометаболитов.
Ряд авторов [4, 6, 7] указывает, что на жидких питательных средах, в том числе и бульоне Хоттингера пик накопления экзотоксинов кишечной палочки происходит в течение первых 12-24 часов. В тоже время для получения вакцинных препаратов, содержащих токсины возбудителей эшерихиоза Новак Д.Д. и Вульф ВТ. [5] предлагают культивировать бактерии не менее 5-7 дней. В связи с чем, был проведен опыт по изучению влияния продолжительности культивирования на накопление токсинов в питательной среде.
С этой целью для опыта отобрали 3 штамма E.coli, у которых методом многократных ПЦР-исследований было подтверждено постоянное наличие генов, отвечающих за выработку STX, LT и ST. В качестве контроля использовали стерильный бульон Хоттингера.
Результаты данного опыта отображены в таблице 3, из материалов которой видно, что накопление токсинов не ограничивается первыми сутками инкубации, а активно продолжается в течение последующих дней.
Таблица 3. Выживаемость инфузорий после прибавления к ним среды культивирования E.coli
| Штамм E. coli | Выживаемость инфузорий (%) после прибавления к ним культуральной среды E. сoli различного срока инкубации (сут) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
| 44(STX) | 78,8±6,1 | 68,4±3,2* | 61,5±2,9* | 53,2±2,5* | 35,4±3,3* | 20,5±1,6* | 12,0±1,2* |
| 546(LT) | 85,6±4,8 | 75,3±4,4 | 63,3±6,2* | 32,7±2,3* | 29,5±2,2* | 19,5±0,8* | 23,1±1,4* |
| 533(ST) | 75,1±5,0 | 77,8±6,7 | 64,8±5,3* | 24,6±1,8* | 16,7±1,5* | 9,3±1,0* | 24,5±2,3* |
| Контроль (бульон Хоттингера) | 97,7±5,4 | 96,8±5,2 | 97,4±4,8 | 98,3±4,0 | 98,2±4,8 | 98,6±3,8 | 99,1±7,3 |
Так, штамм E.coli 44, у которого выявлены гены, отвечающие за выработку STХ 1 и 2, в течение первых суток продуцировал токсин в минимальном количестве, при котором выживало 78,8±6,1% инфузорий. Однако, по прошествии 4-х суток в среде культивирования количество токсинов увеличилось на столько, что количество выживших инфузорий составляло 53,2±2,5%. На 7-е сутки инкубации культуральная среда содержала максимальное количество
шигатоксинов, о чем свидетельствовала гибель 88% простейших.
Динамика накопления токсинов в питательной среде при культивировании E.coli 546 (LT) и 533 (ST) была схожей. Эти штаммы также начинали продуцировать токсины уже с первого дня культивирования, но в течение первых 3-х суток их количество было небольшим. Однако, начиная с 4-х суток, в культуральной среде
концентрация токсинов начала резко нарастать, достинфузорий. Между тем, на 7-й день установили четкую тенденцию снижения токсичности культур этих штаммов, что могло быть связано с инактивацией токсинов в среде культивирования.
Следовательно, результат опыта показал, что выбранные нами штаммы E. coli действительно продуцируют экзотоксины, количество которых в питательной среде зависит от продолжительности культивирования бактерий. Так, для получения LT и ST необходимо культивировать продуцентов не менее 6 дней, но не более 7, а для STX - не менее 7 дней.
Заключение. Таким образом, индикацию токсигенных Exoli среди клинических изолятов можно осуществлять методом биотестирования с использованием инфузорий Stylonychia mytilus, которые высоко чувствительны не только к цитотоксинам (STX и NF), но и цитотонинам (LT и ST) возбудителя эшерихиоза. Кроме того, с помощью Stylonychia mytilus можно контролировать продукцию экзотоксинов E^oN и подбирать оптимальный режим культивирования для получения биопрепаратов.
Список литературы
Резюме
Изучена возможность использования инфузорий с целью биотестирования токсигенных Escheriohia coli, вызывающих диарею у молодняка крупного рогатого скота и свиней. Было испытано 4 вида инфузорий - Paramecium caudatum, Stylonychia mytilus, Colpoda steinii и Tetrahymena pyriformis. Инфузорий выращивали на среде Лозина-Лозинского. Эшерихии инкубировали в бульоне Хоттингера. Суть метода заключалась в том, что на предметное стекло наносили 3 капли суточной среды культивирования инфузорий, после чего проводили подсчет их количества под увеличением 2 х 8, после чего добавляли 1 каплю бульонной тест-культуры E.coli. Спустя 5 минут производили предварительный, а через 2 ч окончательный просмотр и подсчет количества живых инфу-зорий.
Установлено, что инфузории видов Paramecium caudatum, Colpoda steinii и Tetrahymena pyriformis не пригодны для тестирования токсигенных свойств эшерихий, так как первые два не погибают при добавлении культуры патогенной E.coli, а третий вид напротив весьма чувствителен и погибает даже при добавлении стерильного бульона Хоттингера. Специфически чувствительным к экзотоксинам эшерихий оказался только вид Stylonychia mytilus. В наибольшей степени на стилонихии оказывают губительное влияние цито-токсины (STX, СNF) эшерихий, обуславливая гибель данных инфузорий при 2-часовой экспозиции с суточной культурой в количестве 22-47%. Под действием цитотонинов (TL, TS, GEM) эшерихий стилонихии погибали в меньшем количестве - 7-21%. Использование метода биотестирования на стилонихиях позволило установить, что накопление экзотоксинов в среде культивирования происходит в течение 6-7 дней. Однако культивирование энтеротоксигенных эшерихий более 6 дней приводит к инактивации TL-, TS-токсинов.
Ключевые слова: Escheriсhia coli, токсигенность, экзотоксины, шигатоксин, термолабильный токсин, термостабильный токсин, биотестирование, инфузории, Stylonychia mytilus
Сведения об авторе: Терехов Владимир Иванович, доктор биологических наук, профессор, начальник отдела ГКУ КСББЖ "Краснодарская"; 350004, г. Краснодар, ул. Калинина, 15/1; тел.: 8(988) 47421-15; e-mail: vterekhov@list.ru - ответственный за переписку с редакцией. UDC 579.842.11
INDICATION OF TOXIGENIC ESCHERIHIA COLI USING CILIATES
Terekhov V.I.
Summary. Development of a method of biotesting of a toxigenicity of Escheriahia coli with use of ciliates is the purpose of the study. E. coli strains isolated from animals with diarrhea symptoms and corpses were used. Existence of genes which are responsible for development of the thermolabile, thermostable, Shiga-like and necrotizing toxins is established using the method of polymerase-chain reaction. Ciliates of 4 types - Paramecium caudatum, Stylonychia mytilus, Colpoda steinii and Tetrahymena pyriformis - are used as biological targets for these toxins. The environment of cultivation of escherichias - Hottinger's broth, the environment of cultivation of infusorians - Lozina-Lozinsky. Results of research: it is established that with big degree of reliability specifically sensitive to toxins of escherichias were only Stylonychia mytilus infusorians. At addition in habitat of stilonikhiya of 24-hour cultures of the escherichias containing toxins there is a death from 12 to 45% of cages of infusorians. The most toxic effect E.coli - STX 1, 2 and SNF cytotoxins have, these products cause death of 23-45% of Stylonychia mytilus. To a lesser extent for infusorians of this look E.coli tsitotonina - TL and TS under the influence of which 12-22% of infusorians perish are. By a biotesting method on infusorians of Stylonychia mytilus it was determined that the maximum accumulation of cytotonics happens for 5-6 days, and cytotoxins - for 6-7 days.
Key words: Escherichia coli, toxigenicity, exotoxins, Shiga-toxin, thermo-labile toxin, thermostable toxin, biotesting, ciliates, Stylonychia mytilus.
References:
Author affiliation: Terekhov Vladimir I., D.Sc. in Bioljgy, professor, head of the department of the Krasnodar Station of fighting against animal diseases; 15/1, Kalinina st., Krasnodar, 350004; phone: 8(988)474-21-15; e-mail: vterekhov@list.ru - responsible for correspondence with the editorial board.
http://vetkuban.com/num1_201505.html