Новикова М.Б., Балашова Е.А., Лыска В.М., Стрижакова О.М., Сидлик М.В.,
Куриннов В.В. ВНИИВВиМ, г. Покров
Черных О.Ю. Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория, г. Краснодар
Вирусная геморрагическая болезнь кроликов (ВГБК) (синонимы - чума кроликов, вирусная септицемия, вирусная геморрагическая пневмония кроликов, синдром геморраги-ческой септицемии, инфекционный некротический гепатит кроликов, инфекционная трахеопневмония) - остро протекающая высококонтагиозная болезнь, характеризующаяся явлениями тромбогеморрагического синдрома, приводящего к повышению фибринолитической активности сыворотки крови, увеличению проницаемости кровеносных сосудов, выражающейся в образовании кровоизлияний различных типов в ряде органов и тканей.
Эпизоотологии ВГБК присущи характерные особенности. К возбудителю оказались чувствительны только кролики, вне зависимости от породы и пола старше 1,5 месячного возраста. Наиболее чувствительны взрослые, массой 3,0 - 3,5 кг. В начале эпизоотии ВГБК поражаются взрослые кролики, затем все возрастные группы, за исключением подсосного молодняка. Летальность достигает практически 100%. В дальнейшем она несколько снижается и составляет 75-80%.
Факторами передачи возбудителя инфекции могут быть корма, подстилка, навоз, почва, вода, инфицированные больными кроликами, а также пух и шкурки от больных животных и изделия из мехового сырья, поступившие из неблагополучных по ВГБК пунктов. При этом, известно, что вирус может сохраняться в шкурках и тканях животных не менее трех месяцев, тогда как в окружающей среде в условиях пастбища на льняных лентах - менее 1 месяца. Выживание вируса геморрагической болезни кроликов в тканях погибших животных, может, таким образом, служить стойким резервуаром вируса, который может инициировать новые вспышки болезни после продолжительных задержек [3].
Из форм течения болезни наиболее известны сверхострая и острая, кроме того, ряд авторов описывают подострую и хроническую форму. При сверхострой форме болезни кролики погибают мгновенно без проявления каких-либо клинических признаков болезни до начала агонального периода, наступающего внезапно и продолжающегося в течение короткого промежутка времени - от нескольких секунд до 1-2 часов. Как правило, в терминальной стадии болезни животные издают вскрик, падают, у них запрокидывается голова, наступают непродолжительные судороги. Иногда наблюдают кровянистые или кровянисто-пенистые выделения из носа. Образное название этой формы течения болезни - "внезапная смерть с морковкой во рту" - подчеркивает то, что животное погибает без какого-нибудь угнетения или потери аппетита.
Острая форма течения болезни отличается от сверхострой тем, что ей присущи симптомы, которые встречаются нерегулярно и описываются различными авторами по разному. Одни отмечают угнетение, другие - температурную реакцию, учащенное и/или затрудненное дыхание, хрипы, сонливость, атаксию, паралич конечностей, цианоз слизистых. Подострая форма болезни отличается от острой несколько большей продолжительностью и более слабо выраженными симптомами. Практически единственный симптом, отмечаемый при подострой форме болезни и отсутствующий при острой - это редко встречающаяся желтуха [1].
Наиболее значимые патологоанатомические изменения при постановке диагноза на ВГБК: венозный застой в стенках носовых полостей и трахеи; неравномерная окраска, отек и кровоизлияния в легких; увеличение селезенки; кровоизлияния, красно-коричневая окраска и увеличение почек; множественные точечные геморрагии в тимусе и сердце; общий венозный застой крови, выраженный особенно ярко в крупных венах и сердце. В печени отмечают геморрагии, петехии, гиперемию. Она может быть темно-красного цвета, отечна, иметь дряблую консистенцию, а также бледной и уплотненной ("вареная печень"). Обнаружение большинства из этих изменений позволяет поставить патоморфологический диагноз на ВГБК [1].
Для постановки лабораторного диагноза необходимо правильно отобрать пробы патологического материала. При подозрении на ВГБК в лабораторию посылают свежие трупы кроликов целиком или печень, взятую у кроликов не позднее 2-3 часов после гибели животного. Пробы сопровождают пояснительной запиской, в которой подробно излагают эпизоотическую ситуацию в хозяйстве, клинические признаки и патоморфологические изменения и предполагаемый диагноз. Учитывая высокую контагиозность ВГБК, пробы помещают в плотно закрывающуюся посуду (целые полиэтиленовые пакеты), которую снаружи дезинфицируют 5%-ным раствором хлорамина, затем помещают в сосуд со льдом (термочемодан), опечатывают и пересылают в лабораторию с нарочным.
Лабораторную диагностику на ВГБК проводят в специализированных лабораториях и НИИ по особо опасным болезням животных. В ГНУ ВНИИВВиМ разработаны и испытаны на практике методы лабораторной диагностики ВГБК с помощью реакций гемагглютинации (РГА), реакции длительного связывания комплемента (РДСК), реакции задержки гемагглютинации (РЗГА), реакции иммуноферментного анализа (ИФА). В настоящее время для постановки диагноза используют пару реакций - РГА и ИФА.
Постановку РГА и РТГА осуществляют микрометодом в 96- луночных полистироловых пластинах с V- или U-образным дном. Для разбавления всех компонентов реакции используют 0,85 %-ный раствор хлорида натрия на 0,01 М фосфатном буфере рН 6,5-7,0 (ФБР). Эритроциты используют в 0,8-1,0 %-ной концентрации. Примерно после 1 часа инкубации при комнатной температуре или 40оС (диапазон от 20 мин до 2 часов) гемагглютинация в титре > 1:64 считается положительной. Более низкие титры являются сомнительными и должны быть подтверждены в ИФА. По литературным данным примерно 10-20% проб в РГА дают ложноотрицательные результаты. Это бывает обычно у кроликов с подострой или хронической формой течения болезни. В нашей практике был случай, когда при вспышке ВГБК в хозяйстве у 96,7 % исследованных кроликов титр гемагглюти-нинов составил от 0 до 1:32 (всего было исследовано 89 кроликов), при этом, специфический антиген ВГБК в ИФА выявляли в 100 % случаев (табл. 1).
Таблица 1
| Всего проб | Титр в РГА | Титр в ИФА | ||
|---|---|---|---|---|
| 0 | 1:2-1:32 | > 1:64 | > 1:32 | |
| 89 | 26 | 60 | 3 | 89 |
Надо отметить, что этот случай скорее исключение из правил. Чаще всего во время эпизоотии болезнь протекает в сверхострой или острой форме и титр гемагглютининов обычно составляет 1:1000 - 1:4000 и выше. Тем не менее, при диагностировании ВГБК нельзя полагаться только на результаты гемагглютинации, необходимо подтверждать их исследованиями проб патматериала иммунофермен-тным анализом.
Для подтверждения специфичности гемагглютинации испытуемый материал титруют в присутствии специфической и нормальной сывороток. Агглютинацию эритроцитов с испытуемыми антигенами считают положительной, если титр гемагглютининов в присутствии положительной сыворотки (двойная доза) снижается по сравнению с контролем (нормальная сыворотка и ФБР) не менее чем в 16 раз. В опыте используют 8 ГАЕ вируса.
ИФА проводят в сенсибилизированных антителами полистироловых пластинах с плоским дном. Их освобождают от упаковки и промывают. Для этого лунки полностью заполняют отмывочным буфером и резко вытряхивают его из лунок. В лунки вертикальных рядов пластины вносят по 0,1 см3 двукратных (начиная с 1:2) разведений исследуемых и контрольных (специфического и нормального) антигенов на казеин-мертиолятном буферном растворе (КМБ). Через 2 часа инкубирования при 370 С и последующей шестикратной отмывки отмывочным буфером в лунки пластины вносят по 0,1 см3 рабочего разведения (указанного на этикетке) специфического конъюгата на КМБ. Инкубируют в течение 45 мин при 370 С, восемь-десять раз отмывают лунки отмывочным буфером и вносят по 0,1 см3 хромогенного субстратного раствора. После 20-30 минут инкубирования при комнатной температуре проводят учет и оценку результатов.
При фотометрическом учете измеряют оптическую плотность хромогенного субстратного раствора при длине волны 405 нм. Реакцию считают положительной, если оптическая плотность хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали контрольный специфический и исследуемые антигены в 2 и более раз превышает оптическую плотность в лунках, в которых предварительно инкубировали контрольный нормальный антиген.
При визуальном учете реакцию считают положительной при окрашивании хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали контрольный специфический и исследуемые антигены в сине-зеленый цвет и отсутствии окрашивания субстрата в лунках, в которых предварительно инкубировали контрольный нормальный антиген.
Окончательный диагноз в лаборатории может быть поставлен в течение 5-6 часов, т.е. в течение одного рабочего дня. Это обстоятельство чрезвычайно важно, так как своевременная постановка диагноза при столь контагиозной болезни позволяет своевременно начать проведение необходимых санитарно-профилактических мероприятий, направленных на локализацию очага, его ликвидацию и недопущение распространения эпизоотии в соседние районы.
При большом количестве исследуемых антигенов их можно не титровать, а исследовать в одном (например, 1:3 или 1:5) разведении в трех повторностях. Тогда на одной пластине можно проверить 30 проб материалов.
ВГБК необходимо дифференцировать от пастереллеза, сальмо-неллеза, колибактериоза, оспы кроликов, миксоматоза, эймериоза (кокцидиоза), отравления, солнечного и теплового ударов [2].
Пастереллез - бактериальная инфекция, протекающая в виде эпизоотий или небольших вспышек. Болеют кролики примерно с 40-дневного возраста в любое время года. Лечебное действие оказывают гипериммунная противопастереллезная сыворотка и антибиотики.
Сальмонеллез - бактериальная инфекция, протекающая в виде спорадических случаев и вспышек. Наиболее восприимчивы кролики от 1 до 3 месяцев и беременные самки.
Колибактериоз - бактериальная инфекция, протекающая в виде спорадических случаев и вспышек. Болеют крольчата с первых дней жизни в любое время года.
Оспа кроликов - инфекция, вызываемая ДНК-вирусом, протекающая в виде эпизоотий. Болеют кролики разного возраста в любое время года. Лабораторные исследования - микроскопия, биопроба на кроликах и белых мышах.
Миксоматоз - инфекция, вызываемая ДНК-вирусом, проявляющаяся в виде эпизоотий. Болеют кролики всех возрастов и зайцы.
Эймериоз - болезнь, вызываемая простейшими, протекает спорадически и в виде вспышек. Болеют кролики до 4-х месячного возраста в любое время года. Лабораторные исследования - обнаружение под микроскопом ооцист из творожистых узелков в печени.
Заключение. Диагноз на ВГБК ставят на основании эпи-зоотологических, клинических, патоморфологических данных и результатов лабораторных исследований. При диагностировании ВГБК лабораторными методами нельзя полагаться только на результаты гемагглютинации, необходимо подтверждать их исследованиями проб патматериала иммуноферментным анализом. Учитывая высочайшую контагиозность вируса, необходимо тщательно соблюдать правила ветеринарно-санитарного режима при отборе и пересылке проб патматериала в лаборатории. При подозрении на заболевание кроликов ВГБК необходимо принять меры к прекращению реализации кроликов и продуктов их убоя, ограничить передвижение обслуживающего персонала и транспорта, запретить перегруппировку кроликов в самом хозяйстве, а также ввоз новых партий этих животных. Владелец кроликов обязан срочно сообщить о подозрении на ВГБК ветеринарному специалисту ближайшего ветпункта (участка).
Список литературы
Реферат
Сравнивали постановку диагноза ВГБК лабораторными методами - РГА и ИФА. Установлено, что при диагностировании ВГБК реакцией гемагглютинации наблюдали 29,2% ложноот-рицательных результатов, в связи с чем, необходимо подтверждать результаты РГА исследованиями проб патмате-риала в иммуноферментном анализе. Также освещены некоторые вопросы эпизоотологии, отбора проб и сравнительной дифференциальной диагностики.
Ключевые слова: диагностика, вирусная геморрагическая болезнь кроликов (ВГБК), реакция гемагглютинации (РГА), иммуноферментный анализ (ИФА).
Сведения об авторах
Куриннов Виктор Васильевич, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией ВНИИВВиМ; 601120, Владимирская область, Пету-шинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Новикова М.Б., кандидат биологических наук; ведущий научный сотрудник ВНИИВВИМ; 601120, Владимирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Балашова Е.А., кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник ВНИИВВИМ; 601120, Владимирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Сидлик М.В., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник; 601120, Владимирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-2125; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Стрижакова О.М., кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник ВНИ-ИВВиМ; 601120, Владимирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Лыска В.М., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ВНИИВ-ВиМ; 601120, Владимирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Черных Олег Юрьевич, доктор ветеринарных наук, директор ГБУ КК "Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория"; 352140, Краснодарский край, ст. Кавказская, ул. Ленина, 325, кв. 1. 8(238) 6-54-85.
UDC 619:616.9-036.22
PROBLEMS OF DIAGNOSIS OF VIRAL HAEMORRHAGIC DISEASE OF RABBITS
Novikova M. B., Balashova E.A., Lyska V. M., Strizhakova O. M., Sidlik M. V., Kurinnov V. V., Chernykh O.Y.
Summary
Diagnosis on viral haemorrhagic disease of rabbits may be put under epizootiological, clinical, pathological data and laboratory results. So, authors compared the diagnosis of VHDR by laboratory methods - haemagglutination test and ELISA. It was found that haemagglutination test observed 29,2% false-negative results, in connection with what it is necessary to confirm the results in ELISA. VHDR must be differentiated from pasteurellosis, salmonellosis, colibacillosis, smallpox rabbit myxomatosis, eymerioza (coccidiosis), poisoning, solar and thermal shock.
Certain issues on epizootiology, sampling and comparative differential diagnosis are given in the article.
Key words: diagnostics, viral haemorrhagic disease of rabbits (VHDR), haemagglutination test (RHA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)..
References
Author affiliation
Kurinnov Viktor V., D.Sc. in Veterinary Medicine, professor, laboratory manager of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Novikova M.B., Ph.D. in Biology, leading researcher of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Balashova E.A., Ph.D. in Veterinary Medicine, leading researcher of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Strizhakova O.M., Ph.D. in Veterinary Medicine, senior researcher of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Lyska V.M., Ph.D. in Biology, senior researcher of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Sidlik M.V., Ph.D. in Biology, senior researcher of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.
Responsible for correspondence with the editorial board: Chernykh Oleg Yu., D.Sc. in Veterinary Medicine, director of the Kropotkin territorial veterinary laboratory; 303, Krasnoarmeyskaya st., Kropotkin, 352380; phone: 8 (86138) 6-23-14; e-mail: gukkvl50@kubanvet.ru.
http://vetkuban.com/num1_20137.html