Лемясева С.В. ГНУ ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии, г. Москва
В настоящее время в качестве стимулятора роста используют р-агонисты, синтезированные из эндогенного катехола-мина-адреналина, обладающие большой р-селективностью и менее подверженные метаболической деградации. По химическому строению они разделяются на три основных типа: фенольный (сальбутамол, карбутерол, рактопамин), анилиновый (кленбутерол, бромбутерол, мабутерол, мапентерол, цимбутерол) и резорциновый (тербуталин, фенотерол, метапротеренол) [2].
В-агонисты стимулируют рост мышечной массы и регулируют соотношение жировой и мышечной ткани при выращивании сельскохозяйственных животных. Рактопамин увеличивает конверсию корма, способствует уменьшению жировой массы и увеличению мышечной. Также рактопамин обладает липолитическим и анаболическим эффектом, он способен расслаблять гладкую мускулатуру и в силу этого используется в качестве терапевтического средства как антиастматический агент. Вместе с тем при потреблении с пищей у человека препарат может спровоцировать тахикардию, чувство беспокойства, головные боли, мышечные спазмы, тошноту, повышение артериального давления и другие нарушения, вплоть до летального исхода.
Использование рактопамина в качестве стимулятора роста для повышения продуктивности животных запрещено в 160 странах, включая страны Евросоюза, Китай и Тайвань. Однако, использование рактопамина поддерживают в 20 странах, где его применение разрешено, в том числе в Бразилии, США, Канаде, Мексике, Австралии, Аргентине и других странах. В большинстве случаев это связано с доступностью препаратов, содержащих р - агонисты на рынке. В Российской Федерации и Таможенном Союзе рактопамин не допускается к использованию. Это означает, что такая продукция, где обнаружена любая концентрация рактопамина, подлежит уничтожению. Со стороны Росельхознадзора принимаются меры к установлению норм содержания рактопамина в продукции животного происхождения, где участвуют в рабочих группах ЕврАзЭС, Министерство сельского хозяйства РФ и Министерство здравоохранения РФ [1, 4, 5, 6, 7, 8]. В настоящее время Комиссией Кодекса Алиментариус активно обсуждается вопрос определения максимально допустимого уровня содержания рактопамина в мясе.
Для определения в-агонистов используются инструментальные физико-химические методы анализа, такие как жидкостная хроматография высокого давления(ВЭЖХ) и хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС). Эти методы, однако, требуют дорогостоящего оборудования, нуждающегося в высококвалифицированном обслуживании. В силу указанных причин, в последние годы в практике активно используют экспресс-методы контроля безопасности пищевых продуктов. Среди них лидирующее положение занял иммуноферментный метод (далее, ИФА). ИФА требует для контроля малое время анализа, минимальную пробоподготовку, а также низкую стоимость требующегося оборудования и расходных материалов, малые затраты на постановку и поддержку метода. Данный метод весьма надежен - ложные отрицательные результаты исключены, ложные положительные результаты маловероятны [3].
Цель нашей работы: используя метод ИФА, определить предел обнаружения препарата рактопамина и определить его наличие в пробах мяса и печени, поступающих из различных стран и России.
Материалы и методы. Исследования выполнены на основе метода ИФА с использованием набора RIDASCREEN® Ractopamin (производство R-Biopharm AG).
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Материалом для исследования служили пробы мяса и печени свиней и крупного рогатого скота, которые отбирались на ряде предприятиях торговой сети и продовольственных рынках, куда поступали мясо и печень как отечественного, так и импортного производства.
Пробы мяса и печени без жировой ткани измельчали на гомогенизаторе, отбирали навеску гомогенизированной пробы массой 3 г в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой на 50 мл, добавляя 8 мл ацетонитрила, 1 мл этилацетата и перемешивали на вортексе. Затем встряхивали в течение 30 минут, путем переворачивания пробирки вверх-вниз. Центрифугировали на центрифуге Vilocity 18 R Dinamica при ускорении 4000 g при комнатной температуре в течение 10 минут. Перенесли 4 мл супернатанта в другую пробирку и испарили его досуха при температуре 60°С в микроиспарительной системе "МИсСис". Затем растворяли сухой остаток в 2 мл н-гексана, добавляя 1 мл буфера для разбавления проб и перемешивали на вортексе в течение 30 секунд. Центрифугировали при ускорении 4000 g при комнатной температуре в течение 10 минут. Для анализа использовали 20 мкл нижней фазы на лунку. Результаты исследований
В начале исследовали стандартные растворы рактопамина в воде с концентрациями 0 нг/кг, 100 нг/кг, 300 нг/кг, 900 нг/кг, 2700 нг/кг, 8100 нг/кг для самого проведения анализа.
По величинам относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации рактопамина в нг/кг (табл. 1), была построена калибровочная кривая (рис.1). Концентрацию рактопамина в исследуемых растворах в нг/кг определяли по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов. Затем рассчитывали предел обнаружения и предел количественного определения в образцах мяса и печени.
Таблица 1. Результаты ИФА со стандартными растворами рактопамина в воде
| Концентрация стандартных растворов, нг/кг | Средняя оптическая плотность лунки со стандартом | Коэффициент вариации, % | Относительная оптическая плотность раствора в лунке, % | Измеренная концентрация стандартных растворов в лунке (нг/кг) |
|---|---|---|---|---|
| 0 | 1,185 | 0,2 | 100 |
|
| 100 | 1,06 | 1,3 | 89,5 | 100,13 |
| 300 | 0,873 | 3,2 | 73,7 | 299,34 |
| 900 | 0,557 | 8,3 | 47 | 901,75 |
| 2700 | 0,329 | 1,7 | 27,8 | 2697,86 |
| 8100 | 0,148 | 0,5 | 12,5 | 8099,63 |
Рис.1 Калибровочная кривая стандартных растворов
По оси ОХ - концентрация стандартных растворов, нкг/кг
По оси ОУ - относительная оптическая плотность раствора в
Предел обнаружения определяли путем расчета стандартного отклонения шума, т.е. LOD = ОС- + 3><s. Предел количественного определения является минимальным откликом детектора, который может быть измерен, то есть LOQ = ОС + 9xs, где ОС - среднее содержание аналита; s - стандартное отклонение шума. Определение предела обнаружения рактопамина проведены в таблице N°2,3,4.
Таким образом, из табл. 2 и рис. 2 видно, что предел обнаружения рактопамина в говядине составил 0,39 мкг/кг, предел количественного определения рактопамина составил 0,708 мкг/кг.
Таблица 2. Определение предела обнаружения рактопамина в говядине
| Нумерация проб N° п/п | Оптическая плотность раствора проб в лунке, % | Измеренная концентрация раствора проб в лунке (мкг/кг) |
|---|---|---|
| 1 | 84,1 | 0,16 |
| 2 | 81,8 | 0,188 |
| 3 | 71,3 | 0,334 |
| 4 | 84,2 | 0,158 |
| 5 | 73,4 | 0,303 |
| 6 | 76,9 | 0,254 |
| 7 | 77,3 | 0,248 |
| 8 | 75,6 | 0,272 |
| 9 | 76,8 | 0,255 |
| 10 | 76,7 | 0,256 |
| 11 | 75,2 | 0,278 |
| 12 | 74,6 | 0,286 |
| 13 | 78,2 | 0,235 |
| 14 | 79,8 | 0,214 |
| 15 | 77,8 | 0,241 |
| 16 | 82,0 | 0,185 |
| 17 | 85,1 | 0,148 |
| 18 | 78,6 | 0,166 |
| 19 | 75,0 | 0,203 |
| Среднее (Х) | 0,231 | |
| Стандартное отклонение (s) | 0,53 | |
| Предел обнаружения Х +3xs | 0,39 | |
| Предел количественного определения Х + 9xs | 0,708 | |
Рис.2 Схематическое изображение предела обнаружения рактопамина в говядине
Таким образом, из табл. 3 и рис. 3 видно, что предел обнаружения рактопамина в говяжьей печени составил 0,39 мкг/кг, предел количественного определения рактопамина составил 0,762 мкг/кг.
Таблица 3. Определение предела обнаружения рактопамина в говяжьей печени
| Нумерация проб N° п/п | Оптическая плотность раствора проб в лунке, % | Измеренная концентрация раствора проб в лунке (мкг/кг) |
|---|---|---|
| 1 | 70 | 0,266 |
| 2 | 76 | 0,191 |
| 3 | 77 | 0,182 |
| 4 | 89,7 | 0,100 |
| 5 | 67,2 | 0,310 |
| 6 | 75,2 | 0,200 |
| 7 | 75,6 | 0,195 |
| 8 | 76,7 | 0,184 |
| Среднее( Х) | 0,204 | |
| Стандартное отклонение (s) | 0,62 | |
| Предел обнаружения Х +3xs | 0,39 | |
| Предел количественного определения Х + 9xs | 0,762 | |
Рис.3 Схематическое изображение предела обнаружения рактопамина в говяжьей печени.
Таким образом, из табл. 4 и рис. 4 видно, что предел обнаружения рактопамина в свинине составил 0,345 мкг/кг, предел количественного определения рактопамина составил 0,561 мкг/кг.
Таблица 4. Определение предела обнаружения рактопамина в свинине
| Нумерация проб N° п/п | Оптическая плотность раствора проб в лунке, % | Измеренная концентрация раствора проб в лунке (мкг/кг) |
|---|---|---|
| 1 | 74,4 | 0,209 |
| 2 | 70,8 | 0,255 |
| 3 | 74,3 | 0,210 |
| 4 | 72 | 0,238 |
| 5 | 70,8 | 0,255 |
| 6 | 68,3 | 0,291 |
| 7 | 76,3 | 0,262 |
| 8 | 77,2 | 0,179 |
| Среднее( Х ) | 0,237 | |
| Стандартное отклонение (s) | 0,36 | |
| Предел обнаружения Х + 3xs | 0,345 | |
| Предел количественного определения Х + 9xs | 0,561 | |
Рис.4 Схематическое изображение предела обнаружения рактопамина в свинине
На заключительном этапе, используя разработанное нами "Методическое пособие по количественному определению стимулятора роста - рактопамина в мясе и печени на основе метода иммуноферментного анализа", исследовали на наличие рактопамина 43 пробы образцов мяса и печени, поступивших из различных стран: Бразилии, Украины, Литвы, Белоруссии, Уругвая, Германии, Аргентины, Дании, Парагвая, Испании, США и Российской Федерации.
Заключение. Проведенными исследованиями был определен предел обнаружения рактопамина в мясе и печени, который составил 0,4 мкг/кг.
При анализе образцов от 43 проб данным методом, рактопамин был обнаружен в двух пробах свинины из Дании в количестве 0,516 мкг/кг и 0,906 мкг/кг, а также в четырех пробах в говяжьей печени из США, где концентрация рактопамина превысила верхнюю границу рабочего диапазона метода (>8,100 мкг/кг).
Таким образом, на наш взгляд, разработанное "Методическое пособие по количественному определению стимулятора роста - рактопамина в мясе и печени на основе метода иммуноферментного анализа" (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 08.02.2012) может быть использовано для эффективного контроля наличия рактопамина в свинине и говядине, в частности в импортируемых в Российскую Федерацию из различных стран, а также в порядке контроля внутреннего производства свинины и говядины.
Список литературы
Реферат
Статья посвящена разработке методики и определения препарата рактопамина в мясе и печени иммуно-ферментным анализом. Вначале исследовали стандартные растворы рактопамина в воде с концентрациями 0 нг/кг, 100 нг/кг, 300 нг/кг, 900 нг/кг, 2700 нг/кг, 8100 нг/кг для самого проведения анализа. Затем рассчитывали предел обнаружения и предел количественного определения в образцах мяса и печени. Определяли предел обнаружения путем расчета стандартного отклонения шума, то есть L0D = -jC + 3><s. Предел количественного определения является минимальным откликом детектора, который может быть измерен, т.е. L0Q = 30- + 9xs, где -^С - среднее содержание аналита; s - стандартное отклонение шума. Был определен предел обнаружения препарата, который составил 0,4 мкг/кг. Исследовали пробы мяса и печени свиней и крупного рогатого скота, поступившие из Бразилии, Украины, Литвы, Белоруссии, Уругвая, Германии, Аргентины, Дании, Парагвая, Испании, США и Российской Федерации. При анализе образцов от 43 проб данным методом, рактопамин был обнаружен в двух пробах свинины из Дании в количестве 0,516 мкг/кг и 0,906 мкг/кг, а также в четырех пробах в говяжьей печени из США, где концентрация рактопамина превысила верхнюю границу рабочего диапазона метода (>8,100 мкг/кг).
Ключевые слова: гормональные стимуляторы роста, р-агонисты, рактопамин, предел обнаружения, предел количественного определения, калибровочная кривая, относительная оптическая плотность, стандартное отклонение, коэффициент вариации, говяжья печень, говядина, свинина.
Сведения об авторе
Ответственный за переписку с редакцией: Ле-мясева Светлана Васильевна, аспирант лаборатории ветеринарной санитарии на государственной границе, транспорте и мясоперерабатывающих предприятий ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии" РАСХН; Звенигородское шоссе, 5, Москва, Россия, 123022; тел. 8(925)340-38-63, lemyaseva.svetlana@yandex.ru.
UDC 619:614:31:637
DETERMINATION OF HORMONAL GROWTH STIMULANT RACTOPAMINE IN MEAT BY ENZYME IMMUNOASSAY
LEMYASEVA S.V.
Summary
Ractopamine is a drug belonging to the group р-agonist, which stimulates growth of muscle tissue and regulates the ratio of fat and muscle tissue of farm animals. After contact with the food in the human body metabolic disorders, tachycardia, elevation of blood pressure, arrhythmia or myocardial ischemia, as well as symptoms of food poisoning, such as vomiting, dizziness, lethargy, tremors may be observed. The use of ractopamine is prohibited in the Russian Federation and the European Union, but in many other countries, such as the USA, Canada, Brazil, Mexico, Argentina and other countries, ractopamine is used in breeding of animals, particularly pigs and cattle.
Authors carried out the research on the development and testing of methods for quantification of ractopamine in meat and liver of pigs and cattle by enzyme immunoassay. At first authors determined the limits of detection of ractopamine in studied samples of beef, pork, and beef liver, received from a variety of countries (Brazil, Ukraine, Lithuania, Belarus, Uruguay, Germany, Argentina, Denmark, Paraguay, Russia, Spain, USA). Presence of ractopamine in two samples of pork from Denmark in the amount of 0,516 mg/kg and 0,906 mg/ kg was established, as well as in samples of beef liver from the USA, where the concentration of ractopamine exceeded the upper limit of the working range of the method (>8,100 mg/kg).
Key words: hormonal growth promoters, р-agonist, ractopamine, limit of detection, limit of quantification, calibration curve, relative optical density, standard deviation, coefficient of variation, beef liver, beef, pork.
References
Responsible for correspondence with the editorial board:
Lemyaseva Svetlana V., post-graduate student of the laboratory of veterinary sanitation at the border, transport and meat processing plants of the All-Russian Scientific Research Institute of Veterinary Sanitation, Hygiene and Ecology RAAS; 5, Zvenigorodskoe hgw., Moscow, 123022; phone: 8 (925) 340-38-63, e-mail: lemyaseva.svetlana@yandex.ru.
http://vetkuban.com/num1_20134.html