Сергеев О.В. НИИ вирусологии им. Ивановского, г. Москва
Кочетков П.С. ООО "Ветбиохим", г. Москва
Сербис Е.С. ВНИИиТИ биологической промышленности, г. Москва
Введение
Для специфической профилактики эпизоотической диареи свиней (ЭДС) применяют как живые, так и инактивированные вакцины. Показано, что живые вакцины против данного заболевания обладают большей эффективностью, чем инактивированные [4, 5]. Ранее нами была разработана живая вакцина ИС-ЭДС, которую изготовляют из штамма ИС вируса ЭДС, адаптированного к размножению в культуре клеток Vero [2, 3]. Эффективность данной вакцины была показана при массовой вакцинации свиней в ряде хозяйств [4].
При производстве живых вакцин существует необходимость изготовления сухих вакцинных препаратов для длительного хранения и транспортировки. Целью данной работы является разработка способа производственного изготовления и хранения сухой вакцины ИС-ЭДС, обеспечивающего максимальную сохранность вакцинного вируса. Для этого были поставлены задачи: подбор наиболее эффективной для данного вируса стабилизирующей среды, выбор режима замораживания - высушивания и оценка стабильности сухой вакцины.
Материалы и методы
Вирус. Вакцинный штамм ИС вируса ЭДС использовали в виде культуральной суспензии. Вирус выращивали в культуре клеток Vero, как описано ранее [2, 3].
Инфекционную активность штамма ИС вируса ЭДС проверяли титрованием в культуре клеток Vero. Титрование сухой вакцины проводили после регидратации культуральной средой ДМЕМ. Затем готовили серийные десятикратные разведения вируса в бессывороточной среде ДМЕМ, содержащей 5-10 мкг/мл трипсина.
Для титрования вируса использовали культуру клеток со сплошным монослоем в 96-луночных пластиковых планшетах, предварительно отмытые от ростовой среды. Каждое разведение вируса вносят по 0,1 мл в 4 лунки. 4 лунки незаражённой культуры оставляют в качестве контроля. Планшеты с заражённой и контрольной культурами помещают в СО2-инкубатор при (37+0,5)0С. Результаты титрования учитывают по ЦПЭ на 2-4 сутки. Титр вируса определяют по методу Рида и Менча и выражают в тканевых цитопатических дозах, вызвавших дегенерацию 50% заражённых культур, в 1 мл (ТЦД5(/мл).
Стабилизирующие среды. С целью уменьшения потери активности в результате сушки вирусную суспензию смешивали с одной из трёх стабилизирующих (защитных) сред, использованных в работе: декстраново-желатиновой, пептонно-желатозной и молоком.
Декстраново-желатиновая среда состоит из следующих ингредиентов (в граммах на 1 л бидистиллированной воды): декстран 50, желатин 30, гидролизат казеина 20, сахароза30, сорбит 50, гидрофосфат калия 1,25, дигидрофосфат калия 0,5. Растворяли примерно в 2/3 конечного объёма воды. После доведения рН до 7,3-7,4 2М гидроксидом калия добавляли воду до конечного объёма и автокла-вировали при 121-1250С в течение 30 мин.
Пептонно-желатозную среду готовили и применяли, как описано ранее [1].
Молоко готовили альтернативно двумя способами. 1) Сухое обезжиренное молоко стерилизовали гамма-облучением интенсивностью 2 млн рад. Растворяли в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,3-7,4) в весовой пропорции 1:6, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение 10 мин. 2) Коммерческое пастеризованное молоко 2,5 или 3,2 % жирности стерильно разливали в 50-мл центрифужные пробирки, однократно замораживали-оттаивали, затем центрифугировали суспензию в 50-мл центрифужных пробирках при 5 000 об/мин в течение 10 мин. После проверки рН (7,2-7,4) супер-натант сливали и смешивали с вирусной суспензией или хранили в замороженном виде.
Вирусную суспензию смешивали с декстраново-желатиновой средой в отношении 0,7 : 0,3, с пептонно-желатозной средой или молоком - в отношении 1 : 1.
Сублимационная сушка вакцины ИС-ЭДС. Смесь культурального вируса со стабилизирующей средой расфасовывали вручную (малые объёмы) или на автоматической линии по 1 мл во флаконы объёмом 3 см3, устанавливали на каждый флакон резиновую пробку с пазами для удаления влаги.
Для сушки в лабораторной установке Christ Alpha расфасованную вакцину предварительно замораживали в холодильнике при -600 - -70 0С в течение 16 ч, затем помещали в сушильную установку. Объем партий для сушки составлял 80-100 флаконов.
При производственной сушке расфасованную вакцину замораживали в установке Christ Epsilon перед началом сублимации. Сразу после расфасовки в один или два флакона с вакциной помещали датчики температуры. Замораживание проводили в течение 6-8 ч до достижения в материале температуры полного замораживания, - 500С или ниже. Объём производственных партий составлял 1,2 - 20 тысяч флаконов.
Сублимацию проводили при значениях вакуума в камере около 0,16 мБар в течение не менее 50 ч. После удаления из препарата около 90% влаги проводили досушивание при температуре 30-350С в течение 15 ч.
По окончании сублимационной сушки флаконы герметично укупоривали непосредственно в камере сублиматора с помощью прижимных плит, после чего камеру заполняли атмосферным воздухом. После определения вакуума и остаточной влажности флаконы с сухой вакциной закатывали алюминиевыми колпачками.
Определение вакуума в сухой вакцине. Вакцина считается пригодной для практического применения только при наличии вакуума во флаконах. Поэтому все флаконы сухой вакцины проверяли на наличие вакуума с помощью аппарата Д'Арсонваля. Наличие светящегося разряда во флаконах свидетельствует о наличии вакуума.
Определение массовой доли влаги в сухой вакцине. Определяли уменьшение массы сухой вакцины после досушивания её по ГОСТ N° 24061 - 89 (СТ СЭВ 6279 - 89). Массовая доля влаги в сухой вакцине должна быть в пределах 1-4%.
"Ускоренное старение" вакцины. 6 флаконов с сухой вакциной выдерживали в течение 7 суток при 370С. По истечении этого срока определяли активность вируса в усреднённой пробе.
Результаты
Сублимационную сушку в аппарате Christ Alpha проводили для сравнения протективного эффекта трёх стабилизирующих сред в отношении биологической активности вакцинного штамма ИС вируса ЭДС.
Результаты исследования приведены в Таблице 1. Из представленных данных видно, что активность вируса ЭДС снижается ещё на стадиях добавления стабилизирующей среды и последующего замораживания. Потеря активности вируса, смешанного с декстраново-желатиновой средой, составляла 0,00 - 0,24 lg ТЦД50 / мл после замораживания; вируса, смешанного с пептонно-желатозной средой, - 0,33 - 0,50 lg ТЦД50 / мл и вируса, смешанного с молоком, - 0,00 - 0,34 lg ТЦД50 / мл.
Таблица 1. Активность вируса ЭДС при сушке с тремя стабилизаторами
| Стабилизатор | Активность вируса ЭДС, lg ТЦД50 / мл | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Исходная суспензия | Смесь вирус + стабилизатор | После замораживания | После сушки | После ускоренного старения | |
| Декстраново-желатиновый | 6,00 | 5,76 | 6,00 | 5,33 | 4,33 |
| 5,66 | 5,50 | 5,50 | 5,00 | 4,00 | |
| 5,50 | 5,50 | 5,50 | 4,66 | 3,66 | |
| Пептонно-желатозный | 6,00 | 5,66 | 5,66 | 4,76 | 3,23 |
| 5,66 | 5,50 | 5,33 | 4,66 | 3,23 | |
| 5,50 | 5,33 | 5,00 | 4,50 | 3,00 | |
| Молоко обезжиренное | 6,00 | 5,66 | 5,66 | 5,00 | 3,50 |
| 5,66 | 5,50 | 5,50 | 4,66 | 3,33 | |
| 5,50 | 5,33 | 5,33 | 4,66 | 3,00 | |
В результате сушки вирус терял 0,50 - 0,84 lg ТЦД50 / мл в препаратах с первой или второй средой и 0,66 - 0,84 lg ТЦД50 / мл в препаратах с молоком. Таким образом, суммарное снижение активности вируса, по сравнению с исходной куль-туральной суспензией, составило 0,66 - 0,84 lg ТЦД50 / мл при использовании декстраново-желатиновой среды, 1,00 - 1,24 lg ТЦД50 / мл при использовании желатозно-пептонной среды и 0,84 - 1,00 lg ТЦД50 / мл при использовании обезжиренного молока.
Для оценки стабильности вакцинных препаратов при длительном хранении в будущем проводили их испытание методом "ускоренного старения". В ходе ускоренного старения активность вируса снижалась на 1,00 lg ТЦД50 / мл в препаратах с декстраново-желатиновой средой, на 1,43 - 1,53 lg ТЦД50 / мл в препаратах с пептонно-же-латозной средой и на 1,33 - 1,66 lg ТЦД50 / мл в препаратах с обезжиренным молоком.
Дополнительно была проведена сушка вирусной культуральной суспензии с консервированным концентрированным молоком (без предварительного обезжиривания), рН 7,2-7,4. Использовали культуральную суспензию с активностью вируса ЭДС 5,5 lg ТЦД50/мл. Вирусную суспензию смешивали с концентрированным молоком в отношениях 1:1, 2:1 и 4:1. Образцы сушили в сублиматоре Christ alpha. В качестве контроля одновременно сушили смеси вируса с декстраново-желатинным и пептонно-желатоз-ным стабилизаторами в соответственных пропорциях.
Результаты приведены в Таблице 2. Из результатов видно, что концентрированное необез-жиренное молоко как защитная среда менее пригодна по сравнению с обезжиренным молоком. Увеличение концентрации молока в смеси не привело к улучшению сохранности вируса в сухом препарате.
Таблица 2. Активность вируса ЭДС при сушке с молоком в различных пропорциях
| Стабилизатор | Пропорция молоко : вирусная суспензия | Активность вируса ЭДС, lg ТЦД50 / мл | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Смесь вирус + стабилизатор | После замораживания | После сушки | После ускоренного старения | ||
| Молоко концентрированное | 1:1 | 5,24 | 5,33 | 3,50 | 2,00 |
| 1:2 | 5,33 | 5,33 | 3,50 | < 2,00 | |
| 1:4 | 5,50 | 5,50 | 4,00 | 2,33 | |
| Молоко обезжиренное | 1:1 | 5,33 | 5,33 | 4,50 | 3,00 |
Изготовление экспериментальных серий вакцины. В аппарате Christ Alpha изготовили восемь экспериментальных серий живой вакцины ИС-ЭДС из вируса, прошедшего 45-114 пассажей в культуре клеток Vero. Титр вируса в исходной культуральной суспензии был 4,33 - 6,33 lg ТЦД50 / мл. В качестве стабилизирующей среды использовали декстраново-желатиновый стабилизатор.
Данные по изменению активности вируса приведены в Таблице 3.
Таблица 3. Активность вируса в экспериментальных сериях сухой вакцины ИС-ЭДС
| N° серии вакцины | N° пассажа вируса | Активность вируса, lg ТЦД50 / мл | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Исходная суспензия | Смесь вирус + стабилизатор | Сухой препарат | Ускоренное старение | ||
| 1 | 45 | 4,33 | 4,17 | 3,66 | 2,66 |
| 2 | 58 | 5,00 | 5,00 | 4,23 | 3,00 |
| 3 | 91 | 5,66 | 5,50 | 4,83 | 3,66 |
| 4 | 102 | 5,50 | 5,50 | 4,66 | 3,66 |
| 5 | 103 | 6,33 | 6,24 | 5,66 | 4,66 |
| 6 | 111 | 5,66 | 5,66 | 5,00 | 4,00 |
| 7 | 113 | 6,33 | 6,33 | 5,66 | 4,66 |
| 8 | 114 | 6,00 | 6,00 | 5,33 | 4,33 |
Приведённые результаты согласуются с результатами, приведёнными в Таблице 1. В результате смешивания со стабилизирующей средой активность вируса снижалась на 0,00 - 0,16 lg ТЦД50 / мл, в результате сушки - на 0,50 - 0,84 lg ТЦД50 / мл, что дало суммарное снижение активности вируса по сравнению с исходной культу-ральной суспензией на 0,50 - 1,00 lg ТЦД50 / мл. В результате ускоренного старения - на 1,00 - 1,23 lg ТЦД50 / мл.
Данные, приведённые в таблицах 1-3, показывают, что наиболее эффективной из испытанных стабилизирующих сред является декстраново-желатиновая. Кроме того, препараты, содержащие данную среду, наиболее эффективно растворялись при регидрации. Декстраново-жела-тиновую среду использовали в дальнейших экспериментах и для изготовления производственных серий сухой вакцины ИС-ЭДС.
Производственная сушка. За 2010-2011 были изготовлены восемь серий сухой вакцины ИС-ЭДС. Cублимацию проводили в аппарате Christ Epsilon. Использовали вирус, прошедший 80 - 100 пассажей в культуре клеток Vero, с титром активности в исходной культуральной суспензии 5,50 - 6,00 lg ТЦД50 / мл. После определения активности вируса в сухой вакцине рассчитывали число прививочных доз вакцины в фасовке (объём сушки 1 мл), исходя из значения 4,00 lg Т1_1Д50, установленного для одной прививочной дозы вакцины [2].
Результаты приведены в Таблице 4. Из данных, представленных в таблице, видно, что с увеличением объёма смеси, проходящей сушку, вирус ЭДС теряет больше активности в результате сушки. При объёме 1,2 - 2,3 л (серии 1-3) потеря активности составляла 0,66 lg ТЦД50 / мл, что соответствует потере активности при лиофилизации в аппарате Christ Alpha (Табл. 1 и 3). При объёме компоновки 12 - 20 л (серии 4-8) потеря активности была 0,83 - 1,00 lg ТЦД50 / мл.
Таблица 4. Активность вируса в производственных сериях сухой вакцины ИС-ЭДС
| N° серии | Объём КЖ, л | Объём компоновки, л | Активность вируса, lg ТЦД50 / мл | Число прививочных доз в 1 мл | |
|---|---|---|---|---|---|
| Компоновка | Сухой препарат | ||||
| 1 | 1,6 | 2,3 | 5,66 | 5,00 | 6 |
| 2 | 0,84 | 1,2 | 6,00 | 5,33 | 10 |
| 3 | 1,4 | 2,0 | 5,66 | 5,00 | 6 |
| 4 | 15,0 | 21,5 | 5,66 | 4,66 | 3 |
| 5 | 7,4 | 12,0 | 5,50 | 4,50 | 3 |
| 6 | 11,9 | 17,0 | 5,66 | 4,83 | 5 |
| 7 | 14,0 | 20,0 | 5,66 | 4,66 | 3 |
| 8 | 10,8 | 15,5 | 5,50 | 4,50 | 3 |
Хранение вакцины. Для определения срока годности вакцины образцы всех её серий помещали на хранение при +2 - +60С в течение различного срока: 3, 6, 9 и 12 месяцев. По окончании каждого срока хранения определяли активность вируса ЭДС в соответствующих образцах. Все серии вакцины также были испытаны в режиме ускоренного старения.
Результаты исследования приведены в Таблицах 5 и 6. Каждые три месяца хранения сопровождались потерей активности вируса на 0,00 - 0,33 lg ТЦД50 / мл, за один год хранения активность вируса снижалась на 0,50 - 0,83 lg ТЦД50 / мл. После хранения в режиме ускоренного старения, активность вируса в образцах вакцины снижалась на 0,67 - 1,17 lg ТЦД50 / мл (в большинстве случаев на 1,00 lg ТЦД50 / мл).
Таблица 5. Активность вируса в экспериментальных сериях вакцины ИС-ЭДС в процессе хранения при +2 +60С
| N° серии | Активность вируса, lg ТЦД50 / мл | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Сразу после сушки | После ускоренного старения | Через 3 мес. | Через 6 мес. | Через 9 мес. | Через 12 мес. | |
| 1 | 5,00 | 4,00 | 4,83 | 4,50 | 4,33 | 4,23 |
| 2 | 5,33 | 4,50 | 5,50 | 5,00 | 4,83 | 4,66 |
| 3 | 5,00 | 4,33 | 5,00 | 4,66 | 4,66 | 4,50 |
| 4 | 4,66 | 3,66 | 4,50 | 4,00 | 4,00 | 3,83 |
| 5 | 4,50 | 3,50 | 4,33 | 4,00 | 3,66 | 3,66 |
| 6 | 4,83 | 3,66 | 4,50 | 4,23 | 4,00 | 4,00 |
| 7 | 4,66 | 3,50 | 4,50 | 4,33 | 4,17 | 4,00 |
| 8 | 4,50 | 3,50 | 4,50 | НД | НД | НД |
Таблица 6. Активность вируса в производственных сериях вакцины ИС-ЭДС в процессе хранения при +2 +60С
| N° серии | Активность вируса, lg ТЦД50 / мл | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Сразу после сушки | После ускоренного старения | Через 3 мес. | Через 6 мес. | Через 9 мес. | Через 12 мес. | |
| 1 | 3,66 | 2,66 | 3,66 | 3,50 | 3,33 | 3,00 |
| 2 | 4,23 | 3,00 | 4,00 | 4,00 | 3,66 | 3,50 |
| 3 | 4,83 | 3,66 | 4,66 | 4,50 | 4,33 | 4,00 |
| 4 | 4,66 | 3,66 | 4,50 | 4,33 | 4,23 | 4,00 |
| 5 | 5,66 | 4,66 | 5,50 | 5,33 | 5,00 | 5,00 |
| 6 | 5,00 | 4,00 | 5,00 | 4,76 | 4,66 | 4,33 |
| 7 | 5,66 | 4,66 | 5,50 | 5,33 | 5,33 | 5,00 |
| 8 | 5,33 | 4,33 | 5,00 | 4,83 | 4,66 | 4,50 |
Обсуждение
В нашей работе были исследованы четыре вида стабилизирующих сред: молоко (концентрированное и обезжиренное), декстрано-вая и пептонно-желатозная. Максимальное сохранение биологической активности штамма ИС вируса ЭДС в сухом препарате является особенно важным, так как вирус в культуре клеток накапливается в относительно низком титре (105,5 - 106,5 ТЦД50/мл). В результате проведенных исследований было найдено, что декстрановая среда обеспечивает наилучшую сохранность активности вакцинного вируса из испытанных сред.
С использованием декстрановой стабилизирующей среды были изготовлены лабораторные, лабораторно-производственные и производственные серии вакцины с использованием различных сублимационных установок. Анализ изменения биологической активности вакцинного вируса показал, что в результате сушки вирус теряет 1,00
- 1,50 lg ТЦД50 / мл активности. Потеря активности не зависела от типа установки, но была несколько больше при увеличении объёма культуральной суспензии для сушки. Возможно, что различие активности вируса ЭДС в вакцине, высушенной на разном оборудовании, была связана с технологией замораживания. При сушке в лабораторном сублиматоре, замораживание проводили в холодильнике, при сушке в производственном сублиматоре материал замораживали непосредственно на плитах. Выявление зависимости активности сухого вируса от скорости замораживания и, следовательно, структуры сухой таблетки представляется актуальным и составляет предмет дальнейших исследований.
Изучение стабильности сухой вакцины ИС-ЭДС при испытании в режиме ускоренного старения в сравнении с её сохранностью при +2-+60С в течение 12 месяцев показало ценность данного метода для предварительной оценки будущей стабильности вакцины при длительном хранении. Так, испытание 16 серий сухой вакцины методом ускоренного старения показало снижение титра инфекционности на 0,67-1,17 lg ТЦД50 / мл (в среднем на 1,00 lg), тогда как те же серии вакцины через 12 месяцев хранения при +2-+60С снижали активность на 0,50-0,83 lg ТЦД50 / мл (в среднем на 0,70 lg). Из результатов этого исследования можно сделать следующее заключение: если при ускоренном старении сухой вакцины ИС-ЭДС биологическая активность вакцинного штамма ИС вируса ЭДС снижается на 1,00 lg ТЦД50 / мл, можно с большой долей вероятности сказать, что при хранении в течение 12 месяцев при +2-+60С его активность снизится не больше, чем на 0,83 lg ТЦД50 / мл. Таким образом, метод ускоренного старения представляет интерес как экспресс метод оценки качества сухих препаратов, а также новых стабилизаторов и режимов сублимации.
Список литературы
Реферат
Живую вакцину против эпизоотической диареи свиней (ЭДС) сушили в сублимационной установке с целью длительного хранения. Сухую вакцину готовили с одной из трёх защитных сред: декстрановой, желатозно-пептонной и молоком. Сохранность активности вируса ЭДС в сухих препаратах при хранении оценивали методом "ускоренного старения". Из испытанных защитных сред декстрановая оказалась наиболее эффективной. В процессе сушки вакцины с декстрановой средой активность вируса снижалась на 0,66 - 0,84 lg ТЦД5С/мл в одной сушильной установке и на 0,84 - 1,00 lg ТЦД50/мл в другой. Авторы предполагают, что некоторое различие активности вируса ЭДС в вакцине, высушенной на разном оборудовании, была связана с технологией замораживания: перед сушкой (быстрая) или в сушильной камере (постепенная). При хранении при 2 - 60С в течение 12 мес активность вируса снижалась на 0,50 - 0,84 lg ТЦД50/мл, тогда как в результате ускоренного старения потеря активности в среднем была 1,00 lg ТЦД50/мл. Таким образом, метод ускоренного старения представляет интерес как экспресс метод оценки качества сухих препаратов, а также новых стабилизаторов и режимов сублимации.
Ключевые слова: Эпизоотическая диарея свиней (ЭДС), вирус, цито-патическая активность, живая вакцина, стабилизирующая среда, заморозка, сублимация, сушка, сухой препарат, ускоренное старение.
Сведения об авторах
Павел Сергеевич Кочетков, инженер, ООО "ВЕТБИОХИМ",123098, Москва, ул. Гамалеи 16, Моб. Тел. (926) 682-68-87, e-mail: Kochetkovps@mail.ru.
Елена Сергеевна Сербис, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, ВНИиТИ биологической промышленности, 141142, Московская обл., Щелковский р-н, пос. Биокомбината, моб. тел. (915) 055-75-60, e-mail: eserbis@mail.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Олег Витальевич Сергеев, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, 123098, Москва, ул. Гамалеи 16, Моб. Тел. (926) 792-70-74, e-mail: osergeyev123@gmail.com.
UDC 619:616
PRODUCTION OF DRY LIVE VACCINE AGAINST PORCINE EPIzOOTIC DIARRHEA
Sergeyev O.V., Kochetkov P.S., Serbis E.S.
Summary
Live vaccine against porcine epizootic diarrhea is freeze-dried for long term storage. Dry vaccine is made with one of three protective mediums dextran, gelatin-peptone and milk. Safety of viral activity in dry preparations during storage was assessed by the method of "accelerated aging". Dextran was the most effective of the teste stabilizing medium, thus it was used for commercial vaccine manufacturing.
Thus, method of accelerated aging is of interest as rapid method of assessing quality of dry products as well as new of stabilizers and modes of sublimation.
Key words: porcine epizootic diarrhea, virus, cytopathic activity, live vaccine, stabilizing medium, freeze-drying, sublimation, drying, dry preparation, accelerated ageing.
References
Author affiliation
Kochetkov Pavel S., engineer of the VETBICHEM LTD.; 16, Gamaleya, Moscow, 123098; ph.: (926) 682-68-87; e-mail: kochetkovps@mail.ru.
Serbis Elena S., Ph.D. in Biology, senior scientific researcher of the Research Institute for biological Industry; Biokombinata sttl., Shchelkovsky dist., Moscow area; ph.: (915) 055-75-60; e-mail: eserbis@mail.ru.
Responsible for correspondence with the editorial board: Sergeev Oleg V., Ph.D. in Biology, senior scientific researcher of the Ivanovsky Scientific-Research Institute of Virology; 16, Gamaleya, Moscow, 123098; ph.: (926) 792-70-74; e-mail: osergeyev123@gmail.com.
http://vetkuban.com/num1_201310.html