Цибезов В.В., Терехова Ю.О., Баландина М.В., Латышев О. Е.,
Гребенникова Т. В., Верховский О.А. АНО "Научно-исследовательский
институт диагностики и профилактики болезней человека и животных"
Алипер Т.И. НПО "НАРВАК"
Шевкопляс В.Н. Кубанский госагроуниверситет
Африканская чума свиней (АЧС) - вирусная болезнь свиней, характеризующаяся высокой контагиозностью. Возбудителем заболевания является ДНК-содержащий вирус семейства Asfarviridae с размером вириона 175—215 нм [8]. В естественных условиях к АЧС восприимчивы домашние и дикие свиньи всех возрастов. Скорость распространения и степень патогенности вируса АЧС таковы, что эта инфекция способна в короткие сроки (3-5 месяцев) привести к огромным экономическим потерям или даже полной утрате поголовья свиней [1, 6].
Эпизоотологическая особенность АЧС заключается в чрезвычайно быстром изменении форм течения инфекции среди домашних свиней от острого со 100%-ной летальностью до хронического и бессимптомного носительства и непредсказуемого распространения.
Для эффективного использования различных методов диагностики АЧС. направленных на выявление возбудителя или специфических антител, следует учитывать особенности протекания болезни и ее формы. При сверхострой и острой формах выявление вирусоспецифических антител возможно только в пробах селезенки, так как специфические антителопродуцирующие клетки и. следовательно, антитела появляются там на 2-3 сутки после инфицирования, в то время как животные гибнут уже на 3-7 сутки [5]. При подостром и хроническом течении болезни виру-соспецифические антитела в крови появляются на 7-10 сутки, до этого времени целесообразно проводить выявление вирусного антигена или генома в крови, так как данный период течения АЧС характеризуется виремией [7] .
В более поздний срок прижизненная идентификация вирусного антигена возможны только при наличии устойчивой ви-ремии. которая характерна для циркуляции высокопатогенных штаммов и изолятов. Вирус умеренно вирулентных изолятов вызывает перемежающуюся виремию. невысокий уровень смертности при высоком уровне заболеваемости, поэтому в этом случае диагностика АЧС. в основном, базируется на обнаружении антител в сыворотке крови [5. 7]. Таким образом, для эффективной диагностики АЧС необходимы методы специфического определения, как возбудителя, так и антител, образующихся после заражения вирусом.
Одним из перспективных методов определения вирусных антигенов и антител к ним является иммуноферментный анализ (ИФА). Преимущества ИФА заключаются в высокой специфичности, скорости и простоте постановки реакции, сравнительна невысокой стоимости и универсальности применяемого оборудования, возможности автоматизации процедуры анализа. За последнее десятилетие произошли значительные изменения в технологии производства ИФА-наборов. обусловленные результатами научно-практических разработок, связанных с применением моноклональных антител (МкА). которые практически полностью вытеснили поликлональные не только в "сэндвич"-вариантах ИФА. предназначенных для обнаружения антигена, но и в большинстве тест-систем, направленных на выявление антител, где они используются либо в качестве конъюгатов или для адсорбции антигена [9. 10]. Помимо этого, в качестве компонентов ИФА эффективно используются рекомбинантные антигены, обладающие иммунохимическими свойствами нативных белков и представляющие собой хорошо охарактеризованные и стандартизированные препараты [2. 3. 4].
Целью настоящей работы являлась разработка современных иммуноферментных тест-систем для выявления как антител к вирусу АЧС. так и самого вируса АЧС в биологическом материале.
Материалы и методы исследования. Для создания высокоспецифичных иммуноферментных тест-систем необходимо было разработать методику синтеза рекомбинантного белка vp73 вируса АЧС. а также, используя в качестве антигена полученный рекомбинантный белок, получить и охарактеризовать специфические моноклональные антитела к вирусу АЧС. Часть работы была проведена в сотрудничестве с сотрудниками фирмы INGENASA (Испания).
Получение рекомбинантного белка vp73. Для получения рекомбинантного белка фрагмент гена B646L размером 485 п.о., кодирующий конформационный эпитоп белка vp73. был амплифицирован с рекомбинантной плазмидной ДНК pSG72a, несущей полную последовательность этого гена. Экспрессию рекомбинантного белка проводили в клетках E.coli штамма BL21(DE3)pLysS (Novagen). Белок очищали из микробной массы Е. coli BL21(DE3)pLysS на NI-NTA агарозе (Qiagen. USA).
Идентификацию и степень чистоты полученного препарата проверяли методом SDS- электрофореза в 12% полиакриламид-ном геле, его активность и специфичность - в непрямом ИФА и иммуноблоттинге с использованием МкА и референтных положительных и отрицательных сывороток крови свиней.
Получение МкА к рекомбинантному белку vp73. Для получения МкА мышей линии BALB/c 3 раза иммунизировали ре-комбинантным белком vp73 (200 мкг/мышь) с двухнедельным интервалом между иммунизациями. Бустерную дозу (200 мкг/ мышь) вводили за 3 дня до выделения селезенки.
Гибридомные клеточные линии получали путем слияния спленоцитов с перевиваемой клеточной линией миеломы Sp2/0.
Скрининг и оценку иммунологической активности МкА в сыворотке крови или культуральной жидкости проводили методом непрямого ИФА. Позитивные гибридомы реклонировали и наращивали в культуральных флаконах, увеличивая объем (Greiner. Германия). Асцитные жидкости, содержащие МкА, получали после введения гибридомных клеток в брюшную полость праймированных пристаном мышей линии BALB/c. Очистку МкА из асцитных жидкостей осуществляли методом аффинной хроматографии с использованием Белок-А-агарозы (Sigma. США).
Конъюгаты МкА с пероксидазой хрена получали периодатным методом.
Иммуноферментный метод выявления антител к вирусу АЧС в формате конкурентного ИФА. Очищенный рекомбинантный белок vp73 сорбировали в лунках микропланшета в 0.1 М карбонатном буфере. рН=9.5 (концентрация 5 мкг/мл) по 100 мкл в лунку в течение ночи при 4°С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл пероксидазного конъюгата МКА. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл субстратного раствора с тетраметилбензидином (МДЛ. Россия). Инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляли 0.1 мл 1 М H2S04 для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм (А450) измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan EX (Thermo, США).
Иммуноферментный метод выявления антигена вируса АЧС в формате "сэндвич"-ИФА. Для "сэндвич"-ИФА очищенные МкА сорбировали в лунках микропланшета в 0.1 М карбонатном буфере. рН=9.5 (концентрация 10 мкг/мл) по 100 мкл в лунку в течение ночи при 4°С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл очищенного рекомбинантного vp73 в серийных разведениях (от 5 нг/мл до 320 нг/мл) или подготовленные образцы биоматериала. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл пероксидазного конъюгата детектирующих МкА в рабочих разведениях на ФСБТ. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл субстратного раствора с тетраметилбензидином и определяли оптическую плотность как описано выше.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени для выявления ДНК вируса АЧС. Выделение ДНК вируса АЧС из биологических образцов проводили с использованием набора для выделения ДНК на колонках ("Ветбиохим". Россия).
ПЦР в реальном времени проводили на приборе ДТ-96 ("ДНК-Технология". Россия) в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл ДНК. 10 пмоль каждого прайме-ра. 5 пмоль зонда. 0.25 мМ каждого dNTP. 1.25 ед. Taq-полиме-разы, 10 мМ Tris-HCI (рН=9.0). 50 мМ KCI. 0.1% Triton Х-100. 1.5 мМ MgCI2.
Результаты и обсуждение. Рекомбинантный фрагмент конформационного эпитопа белка vp73 вируса АЧС был охарактеризован биохимическими и иммунохимическими методами (электрофорез, иммуноблоттинг. ИФА). Показано, что полученный продукт обладает электрофоретической гомогенностью и детектируется АЧС-специфическими сыворотками. Неспецифические сыворотки не взаимодействуют с полученным продуктом. Рекомбинантный белок был использован в качестве антигена для получения МкА.
После проведения гибридизации было получено 523 гибридных клеточных линий, устойчивых к селективной среде HAT. При первичном тестировании культуральных жидкостей было отобрано 67 клонов реагировавших с рекомбинантным белком vp73.
После повторного клонирования были отобраны 2 клона, обладающих максимальной активностью по отношению к vp73 в непрямом ИФА. Полученные МкА были использованы в дальнейшей работе.
При разработке тест-системы для выявления антител к вирусу АЧС был использован принцип конкурентного ИФА. применяемый в наборе для определения антител к вирусу АЧС INGEZIM РРА СОМРАС (INGENASA. Испания). INGEZIM РРА СОМРАС на основе белка vp73 вируса АЧС обладает 100% чувствительностью и специфичностью и используется в Европе в качестве основного для первичного исследования сывороток при диагностике АЧС. Набор INGEZIM РРА СОМРАС успешно применялся в Испании в рамках национальной программы по искоренению АЧС.
В результате проведенных исследований с использованием полученных рекомбинантного белка vp73 и МкА была разработана тест-система для определения антител к вирусу АЧС "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС". Оценка диагностической чувствительности и специфичности тест-системы проводилась в компании INGENASA на широкой панели референтных сывороток крови сывороток крови, полученных от экспериментально зараженных животных и сывороток крови свиней, охарактеризованных референтными методами в соответствии со стандартами OIE (иммуноблоттинг. реакция непрямой иммунофлуорес-ценции. РИФ) [10] .
При исследовании в системе "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС" 120 сывороток, показавших негативный результат методами непрямого ИФА и иммуноблоттинга. АЧС-позитивных 21 сывороток не выявлено, т.е. специфичность тест-системы составила 100%.
23 сыворотки, положительные в непрямом ИФА, но отрицательные в иммуноблоттинге были определены как отрицательные. Поскольку иммуноблоттинг является официальным референтным методом по рекомендации OIE. специфичность системы "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС" в данном случае также составляет 100%.
30 сильноположительных в непрямом ИФА и иммуноблоттинге сывороток и 5 слабоположительных в непрямом ИФА и сильноположительных в иммуноблоттинге сывороток определены как положительные, т.е. чувствительность системы составила 100%.
Тест-система не выявила перекрестных реакций с антителами к вирусам болезни Ауески. болезни Тешена. КЧС и РРСС.
Диагностическая чувствительность системы была определена при исследовании сывороток свиней, экспериментально зараженных вирулентным штаммом вируса АЧС Ug03H (табл. 1) и слабовирулентными штаммами Е75 и Е70 (табл. 2).
Таблица 1. Результаты анализа сывороток крови свиней после экспериментального заражения штаммом Ug03H в системе "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС
| Время после инфицирования, сут. | Контрольное животное | Инфицированный подсвинок 2 | Инфицированный подсвинок 3 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| А450 | Результат | А450 | Результат | А450 | Результат | |
| 0 | 1.430 - | 1,516 - | 1.495 - | |||
| 3 | 1.274 - | 1.597 - | 1.442 - | |||
| 5 | 1.466 - | 1.288 - | 1.465 - | |||
| 7 | 1.450 - | 0.768 + | 1.213 - | |||
| 10 | 1.618 - | 0.461 + |
| |||
| 12 | 1,446 - |
|
| |||
Таблица 2. Результаты анализа сывороток крови свиней после экспериментального заражения слабовирулентными штаммами Е75 и Е70 в системе "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС"
| Время после инфицирования, сут. | Инфицированный подсвинок 1 | Инфицированный подсвинок 2 | ||
|---|---|---|---|---|
| А450 | Результат | А450 | Результат | |
| 0 | 1.388 - | 1.488 - | ||
| 10 | 0.475 + | 0.592 + | ||
| 15 | 0.615 + | 0.610 + | ||
| 21 | 0.745 + | 0.616 + | ||
| 30 |
| 0.370 + | ||
| 36 |
| 0.338 + | ||
| 45 |
| 0.210 + | ||
| 51 |
| 0.222 + | ||
Из полученных данных следует, что тест-система "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС" позволяет выявлять антитела к вирусу вирулентного штамма на 7 сутки после заражения, к вирусу слабовирулентных штаммов - на 10-е сутки после заражения.
В России набор для выявления антител к вирусу африканской чумы свиней "АЧС-СЕРОТЕСТ/ INGEZIM РРА СОМРАС" использовался в Кропоткинской краевой ветеринарной лаборатории. Показано, что помимо сывороток крови, специфические антитела выявлялись также в суспензии селезенки павших свиней (диагноз на АЧС был подтвержден методами ПЦР и РИФ). Эти результаты расширяют потенциальные возможности практического использования набора.
Таким образом, разработанная тест-система "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС" в формате конкурентного ИФА с использованием рекомбинантного белка vp73 и специфических МкА эффективно выявляет антитела к вирусу АЧС в сыворотке крови инфицированных и переболевших животных.
Полученные в процессе работы МкА к рекомбинантному к vp73 были применены для разработки тест-системы в формате "сэндвич"-ИФА для выявления вируса АЧС (тест-система "АЧС-ИФА").
Для определения оптимальной комбинации захватывающих (сорбированных на планшете) и детектирующих (конъюгированных с пероксидазой) антител для детекции vp73 в формате "сэнд-вич"-ИФА использовали "шахматное титрование" каждого компонента.
В результате проведенных исследований была подобрана пара МкА. при использовании которой чувствительность метода составляла 5 - 10 нг/мл рекомбинантного белка.
Оценку чувствительности и специфичности тест-системы проводили на базе ГУКК "Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория" (г. Кропоткин. Краснодарский край, Россия). В качестве систем сравнения была использованы тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). производства ГНУ "ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии" (г. Покров), тест-система на основе ПЦР в режиме "реального времени" для выявления вируса африканской чумы свиней производства ООО "Ветбиохим" (г. Москва) и набор для выявления вируса АЧС иммуноферментным методом INGEZIM РРА DAS (Ingenasa. Испания). При этом тест-система на основе ПЦР в реальном времени производства ООО "Ветбиохим" содержала систему выделения с использованием колонок, что существенно упрощало процедуру выделения при увеличении аналитической чувствительности.
В исследованиях использовали панель биологического материала, состоящую из 41 образца органов и тканей животных, включающей образцы селезенки от павших и вынужденно убитых свиней и цельную кровь от здоровых и больных свиней (табл. 3).
Таблица 3. Результаты исследования биологического материала свиней на наличие ДНК или антигена вируса АЧС методами ПЦР
| N° | Описание образца | Результаты ПЦР-РВ | Результаты ИФА | ||
|---|---|---|---|---|---|
| Тест-система АНО НИИ ДПБ | Тест-система ВНИИВВиМ | ИФА-набор "INGEZIM РРА DAS" | Тест-система "АЧС-ИФА" | ||
| 1 | Кровь от больных свиней (плазма) | не исследовалась | + | + | |
| 2 | Кровь от больных свиней (плазма) | не исследовалась | + | + | |
| 3 | Кровь от больных свиней (плазма) | не исследовалась | + | + | |
| 4 | Кровь от больных свиней (плазма) | не исследовалась | - | - | |
| 5 | Кровь от больных свиней (плазма) | не исследовалась | - | - | |
| 6 | Селезенка от вынужденно убитых свиней | не исследовалась | - | - | |
| 7 | Селезенка от вынужденно убитых свиней | не исследовалась | - | - | |
| 8 | Селезенка от вынужденно убитых свиней | не исследовалась | - | - | |
| 9 | Селезенка от павших свиней | не исследовалась | + | + | |
| 10 | Селезенка от павших свиней | не исследовалась | + | + | |
| 11 | Селезенка от павших свиней | не исследовалась | + | + | |
| 12 | Селезенка от павших свиней | не исследовалась | + | + | |
| 13 | Кровь от здоровых свиней | не исследовалась | - | - | |
| 14 | Кровь от здоровых свиней | не исследовалась | - | - | |
| 1 5 | Кровь от здоровых свиней | не исследовалась | - | - | |
| 16 | Кровь от здоровых свиней | не исследовалась | - | - | |
| 17 | Селезенка от павших свиней | не исследовалась | + | + | |
| 18 | Селезенка от павших свиней | не исследовалась | + | + | |
| 19 | Селезенка от павших свиней | не исследовалась | + | + | |
| 20 | Кровь от больных свиней | не исследовалась | + | + | |
| 21 | Кровь от больных свиней | не исследовалась | + | + | |
| 22 | Кровь от больных свиней | не исследовалась | + | + | |
| 23 | Кровь от больных свиней | - | - | не исследовалась | - |
| 24 | Кровь от больных свиней | + | + | не исследовалась | + |
| 25 | Кровь от больных свиней | + | + | не исследовалась | + |
| 26 | Кровь от больных свиней | - | - | не исследовалась | - |
| 27 | Кровь от больных свиней | + | + | не исследовалась | + |
| 28 | Кровь от больных свиней | - | - | не исследовалась | - |
| 29 | Кровь от больных свиней | - | - | не исследовалась | - |
| 30 | Кровь от больных свиней | + | - | не исследовалась | - |
| 31 | Селезенка от поросенка 24 мес | + | + | не исследовалась | + |
| 32 | Кровь от больных свиней | + | + | + | + |
| 33 | Кровь от больных свиней | + | + | + | + |
| 34 | Кровь от больных свиней | + | + | + | + |
| 35 | Кровь от здоровых свиней | - | - | - | - |
| 36 | Кровь от здоровых свиней | - | - | - | - |
| 37 | Селезенка от павших свиней | + | + | + | + |
| 38 | Селезенка от павших свиней | + | + | + | + |
| 39 | Селезенка от павших свиной | + | + | + | + |
| 40 | Селезенка от вынужденно убитых свиней | _ | - | _ | _ |
| 41 | Селезенка от вынужденно сбитых свиней | _ | - | - | - |
Сравнительный анализ полученных результатов показал, что разработанная тест-система "АЧС-ИФА" продемонстрировала 100%-ную чувствительность и специфичность и может использоваться в ветеринарной практике для диагностики АЧС.
Заключение. Разработаны высокочувствительные и специфичные иммуноферментные тест-системы для выявления вируса АЧС и антител к нему в биологическом материале. Тест-системы могут быть использованы как для единичных диагностических исследований, так и для широкомасштабного иммунологического мониторинга поголовья.
Список литературы
Реферат
Синтезирован рекомбинантный белок vp73 вируса АЧС и получены специфические моноклональные антитела к вирусу АЧС. Разработаны тест-системы в формате конкурентного ИФА для выявления антител к вирусу АЧС и "сэндвич"-ИФАдля детекции вирусного антигена. Установлена 100%-ная чувствительность и специфичность разработанных тест-систем, которые могут быть использованы для диагностики АЧС.
Ключевые слова: африканская чума свиней, моноклональные антитела, иммуноферментный анализ.
Сведения об авторах
Цибезов Валерий Владимирович, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник АНО "Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных" (АНО "НИИ ДПБ"): 8-499-190-30-54: e-mail: tsibezov@yandex.ru.
Терехова Юлия Олеговна, научный сотрудникАНО "НИИ ДПБ": 8-499-190-30-54: e-mail: 23euro@mail.ru.
Баландина Марина Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудникАНО "НИИ ДПБ": 8-499-190-30-54: e-mail: mbalandina® mail.ru.
Алипер Тарас Иванович, доктор биологических наук, профессор, директор ООО "НПО НАРВАК": 8-499-190-30-54: e-mail: aliper@narvac.com.
Шевкопляс Владимир Николаевич, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры паразитологии, ветеринарно-санитарной экспертизы и зоогигиены Кубанского государственного аграрного университета: 350044. г. Краснодар, ул. Калинина, 13: 8-861-221-58-20.
Латышев Олег Евгеньевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудникАНО "НИИ ДПБ": 8-499-190-75-61: e-mail: oleglat80@mail.ru.
Гребенникова ТВ., доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной биологии АНО "НИИ ДПБ": 8-499-190-75-61: e-mail: t_grebennikova@mail.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Верховский Олег Анатольевич, доктор биологических наук, профессор, президент АНО "НИИ ДПБ"; 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16; 8-499-190-75-61; e-mail: info@dpri.ru.
UDC 619:616.98:578.842.1-076
DEVELOPMENT OF EUSA-DIAGNOSTICS OF AFRICAN SWINE FEVER TslbezovV.V.,TerekhovaYu.O., Balandlna M.V., LatyshevO.E.,Grebennikova T.V., Verkhovsky O.A., Allper T.I., Slievkoplyas V.N.
Summary
Based on recombinant protein vp73 from African swine fever virus (ASFV) and specific monoclonal antibodies solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed to measure both ASFV antigen and antibody. These assays demonstrated 100% sensitivity and specificity and maybe useful technique for epidemiological surveys.
Key words: African swine fever, monoclonal antibodies, enzyme-linked immunosorbent assay.
References
1 - 10. Vide supra. - Print.
Author affiliation
Tsibezov Valery V.. Ph.D. in Biology, leading scientific researcher of the Scientific-research Institute of diagnostics and prophylaxis of human and animal diseases (SRI DPHAD): phone: 8-499-190-30-54: e-mail: tsibezov@yandex.ru.
Terekhova Yuliya 0.. research associate of the SRI DPHAD: phone: 8-499-190-30-54: e-mail: 23euro@mail.ru.
Balandina Marina V.. Ph.D. in Biology, senior scientific researcher of the SRI DPHAD: phone: 8-499-190-30-54: e-mail: mbalandina@mail.ru.
Aliper Taras l„ D.Sc. in Biology, professor, director of the NARVAC®: phone: 8-499-190-30-54: e-mail: aliper@narvac.com.
Shevkoplyas Vladimir N.. D.Sc. in Veterinary Medicine, professor of the department of parazitology. veterinary-sanitary examination and zoohygiene of the Kuban State Agrarian University. Honored Veterinarian of the Russian Federation: 13. Kalinina St.. Krasnodar. 350044: phone: 8-861-221-58-20.
Latyshev Oleg E.. Ph.D. in Biology, senior scientific researcher of the SRI DPHAD: phone: 8-499-190-75-61: e-mail: oleglat80@mail.ru.
Grebennikova TV. D.Sc. in Biology, professor, laboratory manager of molecular biology of the SRI DPHAD: phone: 8-499-190-75-61: e-mail: t_ grebennikova@mail.ru.
Responsible for correspondence with the editorial board:
Verkhovsky Oleg A., D.Sc. In Biology, professor, president of the SRI DPHAD; 16, Gamalei St., Moscow, 123098; phone: 8 (499) 1907561; e-mail: lnfo@dprl.ru.
http://vetkuban.com/num1_20129.html