Современные методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Н.В. Ковалюк, кандидат биологических наук зав. лабораторией биотехнологии СКНИИЖ,
проректор Краснодарского регионального института агробизнеса
В.Ф. Сацук, кандидат сельскохозяйственных наук, директор ООО ИПСХП "Астер"
Е.В. Мачульская, младший научный сотрудник лаборатории биотехнологии СКНИИЖ

ДНК - обязательный компонент любого живого организма (исключение составляют лишь РНК- содержащие вирусы на определен­ных стадиях своего существования). У мыши и человека, кишечной палочки и слона ДНК ус­троена по одному принципу- это полимерная макромолекула, состоящая из звеньев - нук-леотидов. Нуклеотиды бывают 4 видов: А, Т, G и С. У всех живых существ A,T,G,C - нук­леотиды встречаются в составе ДНК, но в раз­личных комбинациях. Чем ближе друг к другу виды расположены на эволюционной лестни-це, тем сильнее похожи их последовательнос­ти ДНК, в то же время даже у представителей одной семьи можно найти такие участки ДНК, которые будут строго индивидуальны.

Использование этого биологического свойства легло в основу метода полиме-разной цепной реакции (ПЦР), который по оценке американского журнала "Science" является самым выдающимся открытием последних лет.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)_это метод копирования участка ДНК, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную ин­дивидуальную последовательность ДНК в ко­личестве, превышающем исходное в 10 мил­лионов раз. Некоторые области применения ПЦР _ выявление вирусных и бактериальных патогенов и высокоэффективный анализ ва­риаций нуклеотидных последовательностей (В. И. Глазко и др., 2000; Р. А. Волкова и др., 2000; А. А. Приймак, 1995).

Лейкоз крупного рогатого скота - хрони­ческая инфекционная болезнь с длительным латентным периодом, поражающая органы кроветворной системы (А.П. Кузнецова, В.П. Смирнов 1998).

Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является этиологическим фактором (первопричиной) лейкоза у коров, телят, реже у других животных: овец, коз и кроликов (Л. Б. Прохватилова и др., 2001; Н. В. Замараева, М. И. Гулюкин, Н. Н. Снежков, 1996; C.Olson et al., 1981). Имеются данные об эксперимен­тальном заражении обезьян (Н. М. McClure, М.Е. Killing, P.Ph. Custer, 1974). Передача ВЛК­РС восприимчивому крупному рогатому, скоту может осуществляться со всеми секретами и экскретами при попадании в них лимфоцитов, зараженных ВЛКРС. Установлено, что для эк­спериментального заражения телят достаточ­но ввести им внутрикожно 2500 лимфоцитов крови от зараженного животного (такое ко­личество лимфоцитов содержится примерно в 0,0005 мл цельной крови). Среди основных факторов, обуславливающих передачу вируса лейкоза, наибольшее значение имеет перенос возбудителя через кровь и препаратов из нее, при ветеринарных и зоотехнических обработ­ках, т.е. ятрогенный способ передачи инфек­ции (В. М. Авилов, В. М. Нахмансон, 1995).

В сперме инфицированных быков-произ­водителей ВЛКРС не выявлен. Не наблюдает­ся определенного влияния передачи ВЛКРС потомству от серопозитивных бы ков-произ­водителей при естественном оплодотворении серонегативных коров. Однако у быков с вос­палением генитальных органов в сперме могут быть л и м фо циты ,инфици ро ванные ВЛКРС.Э к-спериментальноустановлено, что коров можно инфицировать путем нанесения таких лимфо­цитов на слизистую оболочку матки. Изучение возможности передачи вируса лейкоза при эмбриопересадках подтвердили отсутствие передачи ВЛКРС от коров доноров коровам-реципиентам через эмбрионы (Апалькин В.А., Гулюкин М.И., Петров Н.И., 2005).

Вирус лейкоза крупного рогатого скота относится к семейству ретро вирусов (в это же семейство входят родственные ВЛКРС вирусы Т -клеточного лимфолейкоза и ВИЧ). Ретрови-русным инфекциям свойственен ряд общих признаков: длительность инкубационного периода, хроническое или латентное течение, пожизненное вирусоносительство и строго ограниченный круг восприимчивых живот­ных (Б. Г. Орлянкин, 1996; П. Н. Смирнов, В. В. Храмцов, В. В. Смирнова, 2000).

Ретровирусы проникают в клетку, РНК ос­вобождается и превращается в двухцепочеч-ную ДНК - копию, которая встраивается как провирус в ДНК клетки хозяина (Б. Г. Орлян­кин, 1996). Встроенный в геном хозяина про­вирус остается не доступным для воздействия специфических антител и в организме на про­тяжении всей жизни животного.

В благоприятных условиях встроенный провирус формирует новые вирионы; кото­рые отпочковываются от клеточной мембраны для инфицирования новых клеток.

Для диагностики лейкоза применяют кли­нический, патологоанатомический, гистоло­гический, гематологический, серологический и молекулярно - биологический методы.

Всё разнообразие клинических призна­ков лейкоза можно подразделить на специ­фические и неспецифические. Большинство исследователей указывают на первичное по­явление неспецифических признаков, а затем появляются специфические, по которым мож­но поставить диагноз (Н. В. Румянцева, Т.М. Шатерникова, 1963; Г.А. Симонян, 1963; Э.М. Ным и др., 1970). По мере развития заболева­ния у отдельных животных развивается понижение реактивности, вялость. Сравнительно рано у больных лейкозом животных регис­трируют нарушение сердечно - сосудистой деятельности (глухие тоны сердца, иногда их раздвоенность), пульс слабого наполнения, возможна аритмия. К числу неспецифических признаков лейкоза относятся нерегулярная жвачка, поносы, запоры.

Специфические клинические признаки характеризуются прогрессирующим увели­чением поверхностных (околоушных, подче­люстных, предл о паточных, коленной складки, надвыменных), а также внутренних лимфати­ческих узлов, экзофтальмии.(В. М. Лемеш и соавт., 1987). .

Гематологический метод позволят диа­гностировать лейкоз на более ранних ста­диях развития заболевания. Сущность его заключается в обнаружении в периферичес­кой крови повышенного числа лейкоцитов (в основном лимфоидного ряда), слабо диф­ференцированных клеток, а также полимор­фных, атипичных клеток кроветворных орга­нов (Б.Г. Панков,1980; М. И. Гулюкин и др., 1996). Для оценки результатов исследований в различных странах предложено несколь­ко вариантов "лейкозных ключей". В нашей стране в 1965 году был разработан отечест­венный "лейкозный ключ". Все димфоидные диагностические "ключи" основаны на коли­чественных показателях.

Заражение животных ВЛКРС сопровожда­ется выработкой антител к структурным бел­кам вируса. Антитела и вирус циркулируют в организме у зараженных животных на протя­жении всей жизни. Это позволяет применять серологические методы для диагностики ин­фекции, вызываемой этим вирусом (Т.С. К'ос-тенко и др., 1989; А.Г. Берзяк, B.C. Ковалючко, В;С. Гротевич, Л.И. Киричук, 1990).

Разработанная и широко применяе­мая в ветеринарных лабораториях стра­ны реакция иммунодиффузии в геле ага­ра (РИД) с использованием антигена ВЛ в настоящее время остается основным диагностическим методом, по результа­том которого проводят оздоровительные и профилактические мероприятия в не­благополучных по лейкозу хозяйствах. В действующих в настоящее время "Прави­лах по профилактике и борьбе с лейкозом КРС" приоритет отдается именно сероло­гическим исследованиям сыворотки кро­ви. По их результатам судят об инфици-рованности животных вирусом лейкоза. В зависимости от этого определяют мероп­риятия по оздоровлению.

Однако, как и любой диагностический метод, РИД не лишен недостатков.

Так, наличие у лейкоза латентной стадии, когда в крови отсутствуют антитела к вирусу) усложняет диагностику заболевания. Экспе­риментально установлено, что после зара­жения скрытый период инфекции (период от момента заражения до появления антител к вирусным антигенам) продолжается от 2 не­дель до нескольких месяцев, по этому, посте­пенно выводя из стада РИД ~ позитивных жи­вотных, теоретически возможно добиваться полного оздоровления хозяйства от лейкоза (A. Burny, Bruck С, Cleuter Y., 1985). Тем не менее, в оздоровленных стадах, не имевших контактов с другими, через несколько меся­цев или даже лет выделяют животных с анти­телами к ВЛКРС (В. М. Нахмансон, 1986) . Это можно объяснить характерным для лейкоза явлением иммунологической толерантности, когда наблюдают вирусоносительство без ан-тителообразовани'я. Иммунологическая толе­рантность ~ это частичная или полная утрата способности организма вступать в иммунную реакцию со специфическими антигеном. При лейкозе КРС состояние толерантности может развиваться в случае внутриутробного зара­жения плода инфицированными лимфоци­тами матери в период до проявления иммун­ной компетенции, то есть, в первые 3 месяца развития эмбриона; у отдельных животных, например, у глубоко стельных коров, когда иммуноглобулины накапливаются в секрете молочной железы и т. д. Кроме того, бывают случаи серонегативности при наличии сопутс­твующих инфекций, например, вирусной диа­реи (В. А. Белявская и др., 2003).

Метод не прямого иммуноферментного анализа (ИфА), основанный на применении антивидового конъюгата с использованием ферментов-маркеров, обладает значительно большей чувствительностью, по сравнению с РИД, позволяет автоматизировать процесс, то есть уйти от субъективной оценки резуль­татов реакции. Кроме того, с помощью ИФА можно обнаружить антитела к ВЛКРС в мо­локе и моче (Н.Т. Джапаралиев, Л.Б. Прохва-тилова, А.И. Ломакин, П.К.Аянот,2000; К.Т. Carli, et al.1993; K.T.Carli , Sen А., Н. Batmaz, E.Kennerman,1999). Несмотря на очевидные достоинства, достоверность ИФА все же свя­зана с иммунологическими реакциями, и по­этому не всегда адекватна.

В связи с изложенным выше, с целью ускорения полного оздоровления стад КРС от лейкоза, целесообразно совместно с РИД и не прямым ИФА использовать методы, выявляющие непосредственно вирус или провирус у инфицированных животных.

Перспективной в этом плане является по-лимеразная цепная реакция (ПЦР) (Мальцева Н.А. и др., 2004). Этот метод позволяет выяв­лять провирусную ДНК или вирусную РНК в образце крови животного. Анализ литератур­ных данных,позволяет расположить методы-диагностики лейкоза в порядке возрастания чувствительности, точности и специфичности в следующий ряд: РИД < ИФА < ПЦР

В настоящее время, широкое примене­ние метода ПЦР в диагностике лейкоза, на наш взгляд, сдерживается следующими фак­торами: высокой стоимостью оборудования и реактивов для ПЦР, отсутствием на рынке сертифицированных диагностикумов и не до конца осознанные местом ПЦР-диагностики в системе противолейкозных мероприятий.

Важно понимать, что ни один из существу­ющих методов не лишен недостатков. Так ряд авторов D. Beier, P. Blankenstein,, Н. Fechner, (1992); P. Blankenstein, Н. Fechner, A. Looman, A. Beier, A. Marguardt, D. Ebner (1998) сообща­ет, что довольно часто выявляется несоответс­твие результатов ПЦР и РИД ПЦР - позитивные особи выявляются среди РИД - отрицатель­ных животных, а ПЦР - негативные, среди РИД _ позитивных. Вполне вероятно, что, не смотря на очень высокую чувствительность ПЦР, в развитии лейкозного процесса бывают такие периоды, когда уровень провируснои ДНК минимален. В таких случаях РИД оказы­вается более информативна. Поэтому имеет смысл "дочищать" ПЦР РИД - и ИФА - нега­тивных животных, при таком комбинирован­ном использовании диагностических методов гарантировано быстрое и эффективное оздо­ровление стада.

Учитывая, то, что ПЦР обеспечивает выяв­ление непосредственно провируса.то есть ре­зультат анализа не зависит ни от возраста, ни от состояния животного, этот метод можно ис­пользовать для разделения телят на инфици­рованных и здоровых в возрасте до 5 месяцев, то есть до того момента, когда использовать РИД нет смысла. Обнадеживающие результа­ты получены В.В. Макаровым, Д.П. Гриниши-ным (2005), которым удалось доказать, что использование комбинированной РИД/ПЦР диагностики более чем в два раза ускоряет процесс оздоровления стада от лейкоза, чем использование только РИД - диагностики.

Название хозяйства	Исследовано образцов крови	Возраст животных	ПЦР "+" результаты, %
"Дружба" Калининский район	35	3-4 мес.	25,7
"Бейсуг" Пр.-Ахтарский район	70	2-3 года	58,6
"Дружба" Пр.-Ахтарский район	50	3-4 года	72,0
СЗАО СКВО Рост, область	117	3-4 года	0
ЗАО "Суворова" Пр.-Ахтарский район	121	3-4 года	47,9
ОАО "Племзавод "Кубань"	354	Згода	0,004
"Привольное" Каневского р-на	90	З-б мес.	44,5
ЗАО "Племзавод Гулькевичский"	48	3-4 года	58,3
"Урожай" Каневского р-на	12	3-4 года	25,0
ООО "Животноводческий комплекс "Ольгинский"	97	1-5 лет	32,9
Учхоз "Краснодарское"	19	3-5 лет	100,0

Важной областью применения ПЦР явля­ется исследование импортированного скота, находящегося в карантине, с целью предо­твращения завоза ВЛКРС из одной страны в другую.

Таким образом, возможны, по край­ней мере, три области успешного приме­нения метода ПЦР в диагностике лейкоза: выявление носителей провируснои ДНК среди РИД и ИфА-отрицательных жи­вотных, исследование вновь завозимых в хозяйство животных и выявление зара­женных телят в раннем возрасте.

В лаборатории биотехнологии СКНИИЖ с использованием метода ПЦР исследовано 1013 образцов крови на наличие провируснои ДНК ВЛКРС. В таблице 1 приведены данные по инфицированности животных различных хо­зяйств ВЛКРС.

Анализируя полученные результаты, хотелось бы отметить следующее. Живот­ные лишь одного из хозяйств (СЗАО СКВО) оказались полностью свободны от носи-тельства провируснои ДНК ЛКРС. Телки голштинской черно-пестрой породы в это хозяйство были завезены из Голландии и не имели контактов с местными животными. Среди других импортных животных (ОАО "Племзавод "Кубань" п=354, завезены из Венгрии) методом РИД не были выявлены положительно реагирующие, а с помощью ПЦР удалось обнаружить 1 носителя прови­руснои ДНК ЛКРС. Более того, провирусную ДНК выявили и в пробе крови теленка, по­лученного от ПЦР - позитивного животного. Носители провируса были удалены из стада. В хозяйстве ООО "Животноводческий комп­лекс "Ольгинский" из 97 проанализирован­ных образцов 67 были получены от РИД - от­рицательных животных. 15 из них оказались ПЦР _ положительными.

Анализируя данные по носительству про-вируса, установили, что процент инфициро­ванных телят к 3-4 месяцам (на основании ПЦР - исследований) практически соответс­твует проценту РИД - позитивных животных того же хозяйства, но в более позднем возрасте (к 3 годам). Это, вероятнее всего, сви­детельствует о том, что заражение животных происходит в ранние сроки жизни (транспла-центарно и до 3 мес), а первые иммунологи­ческие признаки болезни появляются у боль­шинства животных после первой лактации.

Следовательно, если проводить разде­ление телочек методом ПЦР на носителей провируса и здоровых в первые 2-3 неде­ли жизни животного, можно оздоравли-вать хозяйства значительно быстрее.

http://vetkuban.com/num1_20073.html